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采用串联亲和纯化质谱分析DJ-1的相互作用蛋白: 2021年; 目的采用RNA干扰技术下调DJ-1基因在肺鳞癌细胞HTB-182中的表达,采用串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术寻找DJ-1在HTB-182细胞系中的相互作用蛋白。方法构建靶向DJ-1基因siRNA慢病毒载体,感染HTB-182细胞(DJ-1 siRNA组),并设立慢病毒载体对照组(Control siRNA组)及空白对照组,采用Western blot法检测DJ-1蛋白表达水平,建立内源性的DJ-1蛋白表达沉默的si-DJ-1-HTB-182细胞。设计DJ-1的特异性引物,构建带有链霉素结合肽标签(SBP)、钙调蛋白结合肽标签(CBP)的DJ-1表达质粒pNTAP-DJ-1,用脂质体稳定转染细胞系DJ-1 siRNA HTB-182,G418筛选阳性克隆,Western blot进行验证,TAP-MS技术寻找DJ-1的相互作用蛋白。结果DJ-1 siRNA干扰组中DJ-1的蛋白质表达明显低于空质粒(NC)组和空白对照(BC)组(P<0.05);成功构建了稳定表达pNTAP-DJ-1质粒的HTB-182细胞系;TAP-MS筛选到DJ-1相互作用的三个蛋白质:细胞角蛋白1(Keratin 1)、细胞角蛋白10(Keratin 10)和NADPH氧化酶活化蛋白P47(P47 Px)。结论Keratin 1、Keratin 10和P47 Px可能是DJ-1蛋白的相互作用蛋白。; 魏旺丽谭潭崔亚娟汤参娥; 关键词：相互作用蛋白

风疹病毒蛋白串联亲和纯化质粒的构建及表达纯化: 2020年; 目的为了研究风疹病毒(rubella virus,RV)蛋白及其相互作用蛋白在宿主细胞中的功能,构建带eXact/6His串联亲和纯化标签的重组RV基因慢病毒表达载体并在293T细胞中表达纯化。方法从风疹病毒全基因组中克隆获得E1、E2、Capsid、P90及P150基因序列,将基因序列导入含有eXact/6His标签的pCDH-CMV-EF1-Puro慢病毒表达载体中。将构建的pCDH-CMV-eXact/6His/RV-EF1-Puro表达载体和包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞后获得慢病毒颗粒,随后感染293T细胞并通过嘌呤霉素进行筛选。串联亲和纯化重组蛋白eXact-6His-RV,并通过6His抗体进行检测。结果成功构建带eXact/6His串联亲和纯化标签的重组RV蛋白慢病毒表达载体,并实现在293T细胞中的稳定表达及纯化。结论eXact-6His-RV重组蛋白在293T细胞中的成功表达及纯化,为进一步研究风疹病毒蛋白及其相互作用蛋白在宿主细胞内的功能奠定了实验基础。; 韩月雯吴瑞马超锋李园园; 关键词：风疹病毒串联亲和纯化慢病毒载体蛋白相互作用

串联亲和纯化技术联合质谱鉴定RSK4变异体的相互作用蛋白: 研究目的：乳腺癌，一个人们闻之色变的名词，根据最新的统计数据，在中国每年的新诊断出的乳腺癌病例及死亡病例分别占全球的12.2％和9.6%，这一数值的持续升高，加速着我们对乳腺癌研究的不断深入。Berns及SUN Y等人先...; 田斯琦; 关键词：乳腺癌相互作用蛋白

利用串联亲和纯化的方法筛选耻垢分枝杆菌中MutM的相互作用蛋白: 2015年; Mut M(formamidopyrimidine-DNA glycosylase,Fpg)是原核生物碱基切除修复系统(BER)中同时具有DNA糖苷酶和脱嘌呤/脱嘧啶AP裂解酶活性的一种双功能酶,不但可以识别DNA损伤,而且能切除损伤的碱基,从而参与到许多种损伤的修复过程.除了高致突变率的8-羟基鸟嘌呤(8-oxoguanine,8-oxo G)外,Mut M在其他损伤修复中具体作用机制还不清楚.本研究主要以耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)为研究对象,利用串联亲和纯化技术和质谱相结合的方法对可能与Mut M相互作用的蛋白因子进行发现和鉴定,并于体外用Far-western和GST pull-down方法对鉴定出的蛋白DEAD-box rna helicase、Rps C、Uvr A与Mut M的相互作用进行了验证.实验结果表明,利用串联亲和纯化方法来发现Mut M相互作用的蛋白是切实可行的.本研究为进一步深入研究Mut M在其参与的损伤修复中的具体机制提供了切入点.; 范尚华周盈张泓泰Joy Fleming喻子牛张先恩毕利军; 关键词：耻垢分枝杆菌碱基切除修复串联亲和纯化

串联亲和纯化技术联合质谱鉴定PSK4及其变异体的相互作用蛋白: 刘日强; 文献传递

串联亲和纯化技术筛选Bat3的相互作用蛋白质被引量：1: 2014年; 目的寻找与Bat3结合的蛋白质。方法采用串联亲和纯化技术,在Bat3编码序列羧基端融合Strep2和FLAG 2个分子标签,以此为诱饵筛选与其特异结合的蛋白质,最后进行质谱鉴定。结果筛选到1种蛋白质分子,命名为Ubl4A,免疫共沉淀结果显示Ubl4A可与Bat3相互结合。结论成功建立了串联亲和纯化技术平台,分离出可与Bat3相互作用的蛋白质Ubl4A。; 吴为李琴山宋伟缪时英王琳芳; 关键词：凋亡串联亲和纯化

串联亲和纯化技术联合质谱鉴定乳腺癌细胞中LOX相互作用蛋白: 目的:构建带StrepII/FLAG串联亲和标签的重组赖氨眈氧化酶(Lysyloxidase， LOX)蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌MOA-MB-231细胞中表达，利用StrepII/FLAG标签纯化富集LOX的复合体，...; 刘侠; 关键词：赖氨酰氧化酶相互作用蛋白慢病毒载体; 文献传递

串联亲和纯化技术在研究细胞内相互作用蛋白质中的应用被引量：1: 2014年; 为了进一步研究蛋白质功能并建立蛋白质在细胞内的相互作用网络,各种研究相互作用蛋白质的方法应运而生,串联亲和纯化(TAP)技术就是其中之一。TAP利用基因重组技术将标签基因融合入靶蛋白基因,转入细胞系后表达带标签的靶蛋白,使用标签的特异性对靶蛋白进行纯化和相关研究,而该技术在实际运用会遇到标签选择、标签位置的选择和重组表达等一系列问题,该文介绍TAP技术在实际使用中的技术要点。; 刘侠韦薇; 关键词：串联亲和纯化相互作用蛋白质蛋白质组学

紫外交联合并串联亲和纯化高效鉴定蛋白复合物组分的RNA结合活性: 2014年; RNA结合蛋白在RNA的生成与代谢中发挥着重要作用.我们在近年报道的PAR-CLIP(photoactivatableribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation)技术的基础上建立了一套快速、有效鉴定RNA结合蛋白的实验方法:以串联亲和纯化替代一步免疫沉淀获得高纯度蛋白-RNA复合物;将Sypro Ruby蛋白染色与RNA放射自显影相结合判断复合物中哪种或哪些组分为RNA结合蛋白,该方法命名为紫外交联合并的串联亲和纯化(cross-linkingand tandem affinity purification,CLiTAP).运用该方法对布氏锥虫的三种锌指蛋白ZC3H7、ZC3H34和ZC3H5进行分析,发现ZC3H7作为帽结合蛋白复合物的核心组分具有很强的RNA结合能力;ZC3H34结合RNA能力较弱,但其互作蛋白具有强的RNA结合活性;相比之下,ZC3H5及其复合物组分皆无RNA结合活性.这些结果表明,CLiTAP与蛋白质鉴定方法相结合,能够有效鉴定靶蛋白复合物中的RNA结合蛋白种类,也为进一步定位RNA结合位点、研究RNA结合蛋白的结构及作用机制奠定了基础.; 岳莎周淑如郭学敏; 关键词：串联亲和纯化 RNA结合蛋白布氏锥虫

利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分: 2014年; 目的利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分。方法将RFP、NLK和其突变体NLKK155M克隆至本室改造的带有Flag和Strep双标签的反转录病毒载体pMSCVpuro中,通过酶切鉴定并测序验证其构建的正确性。采用反转录病毒感染结合嘌呤霉素筛选的方法,获得稳定表达RFP、NLK、NLK突变体NLKK155M的HCT-116细胞株,Western blot法检测目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的表达。采用串联亲和纯化结合质谱分析,分离、鉴定与NLK结合的蛋白。结果构建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLKK155M质粒经测序证明构建正确。携带上述基因的反转录病毒感染的HCT-116细胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常表达。经串联亲和纯化和质谱分析,发现多个可能与NLK结合的蛋白。结论本研究采用串联亲和纯化结合质谱分析成功鉴定了若干可能与NLK及其突变体NLKK155M结合的蛋白质。; 梁俊波缪时英王琳芳; 关键词：串联亲和纯化质谱分析

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