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一种小鼠 胚胎 成 纤维细胞 恶性转化株及其应用 本发明公开了一种基于3D培养条件下温石棉诱导的小鼠 胚胎 成 纤维细胞 恶性转化株及其应用,属于生物学和肿瘤学技术领域。所述小鼠 胚胎 成 纤维细胞 恶性转化株分类命名为:小鼠 胚胎 成 纤维细胞 系NIH3T3/3As‑T,保藏号为:CCTC... 张芳芳 朱丽瑾 苑修源 张敏 肖芸 鞠莉 余珉 应士波 高雅楠一种小鼠 胚胎 成 纤维细胞 直接重编程为黑素细胞 的方法 本发明提供一种小鼠 胚胎 成 纤维细胞 直接重编程为黑素细胞 的方法,包括如下步骤:制备高质量的浓缩慢病毒用于转染备选转录因子;将小鼠 胚胎 成 纤维细胞 直接重编程为黑素细胞 ;优化筛选可用于黑素细胞 直接重编程的转录因子;鉴定诱导黑素细胞 ... 李遇梅 张怡萱 刘莉萍 郑允文利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠 胚胎 成 纤维细胞 株 2024年 【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (NIH3T3)Quaking基因敲除细胞 株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞 增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成 功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞 中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞 进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞 后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞 株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞 株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞 的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成 功构建了小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (NIH3T3)Quaking基因敲除细胞 株,为后续研究Quaking基因在小鼠 生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。 高登科 马白荣 郭怡莹 刘薇 刘薇 靳亚平 靳亚平 江舟关键词:小鼠胚胎成纤维细胞 基因敲除 胰高血糖素样肽-1通过下调二肽基肽酶-4/核因子-κB信号通路抑制氧化应激诱导小鼠 胚胎 成 纤维细胞 炎症的机制 2024年 目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)通过调控NADPH氧化酶-4(Nox-4)及二肽基肽酶-4(DPP-4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路,影响脂肪炎症的发生及其相关机制。方法:小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (3T3-L1细胞 ,Procell,CL-0006)进行传代培养并进一步分为空白对照组(Control)、加入5μg/ml内质网应激诱导剂衣霉素(TM)组及GLP-1组(加入10 nmol/L GLP-1预处理24 h后,加入TM),3组培养24 h;在3T3-L1脂肪细胞 中用小干扰RNA(siRNA)沉默DPP-4的表达,后分别提取总RNA和提取蛋白,其浓度测定并进行实时反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)实验分析Nox-4、GLP-1受体(GLP-1R)、NF-κB亚基(p-50、p-65)蛋白以及炎性因子如单核细胞 趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞 介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA和蛋白表达水平,组间均数比较采用方差分析。结果:3T3-L1脂肪细胞 加入GLP-1后,GLP-1组GLP-1R的mRNA表达水平高于TM组(1.10±0.05比0.47±0.07),差异有统计学意义(F=183.912,P<0.001);其DPP-4和Nox-4的mRNA表达水平低于TM组(2.68±0.30比1.31±0.15;2.04±0.21比1.38±0.11),差异有统计学意义(F=90.196、60.166,P<0.001)。GLP-1组p-50和p-65的蛋白表达水平低于TM组(1.48±0.23比1.22±0.03;1.66±0.13比1.15±0.06),差异有统计学意义(F=13.049、73.488,P<0.001);GLP-1组MCP-1、IL-6及TNF-α的mRNA相对表达水平低于TM组(1.62±0.18比0.95±0.03;1.80±0.32比1.23±0.02;2.05±0.31比1.30±0.03),差异有统计学意义(F=45.140、19.524,F=35.933,P<0.001)。si-DPP-4敲低组的p-50和p-65的蛋白表达水平低于TM组(1.42±0.07比1.13±0.02;1.59±0.18比1.12±0.03),差异有统计学意义(F=93.111、30.849,P<0.001);si-DPP-4敲低组的Nox-4(2.13±0.10比1.34±0.05,F=219.708,P<0.001)和炎性因子MCP-1、IL-6及TNF-α的mRNA表达水平低于TM组(1.46±0.06比1.19±0.04,1.79±0.13比1.23±0.05,2.26±0.14比1.32±0.07),差异有统计学意义(F=87.228、72.369、153.372,P<0.001)。结论:GLP-1通过下调DPP4/NF-κB信号通路抑� 买买提·依斯热依力 仙米西努尔·买买提明 依力汗·依明 王永康 阿巴伯克力·乌斯曼 克力木·阿不都热依木关键词:脂肪细胞 炎性因子 小鼠 胚胎 成 纤维细胞 复制性衰老模型的构建及衰老溶酶体功能检测2023年 目的构建小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (MEF)复制性衰老模型,检测衰老溶酶体相关功能改变,为衰老相关溶酶体疾病提供有效的细胞 模型。方法通过酶消化法分离提取MEF,体外连续传代培养构建MEF复制性衰老模型,实时定量PCR(qPCR)检测衰老标志物p16和p21,衰老相关β⁃半乳糖苷酶(SA⁃β⁃gal)染色方法进一步验证衰老状态;通过溶酶体探针类染料LysoTracker Red DND⁃99探针及LysoSensor Yellow/Blue DND⁃160双激发探针追踪酸性溶酶体定性检测溶酶体酸碱性及定量检测溶酶体pH值;通过偶联自淬BODIPY®染料的牛血清白蛋白(DQ⁃BSA)检测衰老溶酶体的降解能力。结果qPCR和SA⁃β⁃gal染色结果显示,MEF复制性衰老模型构建成 功。与年轻P3代MEF相比,衰老P9代MEF溶酶体的酸性明显丧失,差异有统计学意义(P<0.0001),衰老P9代MEF溶酶体的降解能力明显降低(P<0.05)。结论成 功构建MEF复制性衰老细胞 模型,并证明衰老MEF溶酶体的酸性丧失以及降解能力下降。 朱海珍 姚铖铖 周涛 李爱玲 潘欣关键词:细胞衰老 小鼠胚胎成纤维细胞 溶酶体 酸化 细胞模型 线粒体自噬对高糖诱导小鼠 胚胎 成 纤维细胞 活化作用的影响 被引量:2 2023年 目的:探究线粒体自噬对高糖(HG)诱导小鼠 胚胎 成 纤维细胞 系NIH 3T3活化作用的影响与机制。方法:体外培养NIH 3T3细胞 ,用40.0 mmol/L葡萄糖诱导NIH 3T3细胞 ,构建糖尿病心肌病细胞 模型,24 h后检测细胞 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col-I)、p62和微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)蛋白表达水平。培养NIH 3T3细胞 ,分别设置正常糖(NG;5.5 mmol/L葡萄糖)组、HG(40.0 mmol/L葡萄糖)组、NG+3-甲基腺嘌呤(3-MA;自噬抑制剂,0.2 mmol/L)组和HG+3-MA组,处理细胞 24 h。采用JC-1活细胞 染色检测各组细胞 线粒体膜电位;Ki-67免疫荧光染色检测各组细胞 增殖情况;线粒体自噬检测试剂盒检测各组细胞 线粒体自噬情况;Western blot检测各组细胞 α-SMA、Col-I、p62、LC3-I和LC3-II蛋白表达水平,并比较LC3-II与LC3-I的比值。结果:JC-1法检测线粒体膜电位结果显示,与NG组比较,HG组NIH 3T3细胞 的线粒体损伤减轻;自噬抑制剂3-MA处理后,NG+3-MA组和HG+3-MA组线粒体膜电位明显降低;与HG组比较,HG+3-MA组线粒体膜电位降低。Ki-67免疫荧光检测结果显示,与NG组比较,HG组NIH 3T3细胞 的Ki-67阳性率明显升高;自噬抑制剂3-MA处理后,NIH 3T3细胞 的Ki-67阳性率降低。Mitophagy检测试剂盒结果显示,与NG组相比,HG组的线粒体自噬通量明显增强;与HG组比较,HG+3-MA组线粒体自噬通量明显降低。Western blot检测结果显示,与NG组比较,HG组NIH 3T3细胞 中α-SMA、Col-I、LC3-I和LC3-II蛋白相对表达水平均明显升高,而p62蛋白相对表达水平降低;与HG组比较,HG+3-MA组α-SMA、Col-I、LC3-I和LC3-II相对表达水平均明显降低,p62蛋白相对表达水平升高;与NG组比较,HG+3-MA组中α-SMA蛋白相对表达水平降低。结论:HG刺激NIH 3T3细胞 增殖及活化,合成 过多的胶原蛋白等细胞 外基质蛋白,其作用机制可能与HG诱导线粒体自噬增强有关。 周喆 王德琼 张黎 张钟健 李霜 杨永健关键词:糖尿病心肌病 心脏成纤维细胞 灰毡毛忍冬乙醇提取物减缓D–半乳糖致小鼠 胚胎 成 纤维细胞 氧化应激的效果 2023年 为探讨灰毡毛忍冬乙醇提取物对D–半乳糖诱导小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (MEF)氧化应激的保护作用及其潜在机制,通过广泛靶标代谢组测序和高效液相色谱法检测灰毡毛忍冬乙醇提取物中活性物质,采用20 mg/mL的D–半乳糖处理MEF细胞 ,建立细胞 衰老模型,试验设置对照组(0 mg/mL的D–半乳糖)、模型组(20 mg/mL的D–半乳糖)、灰毡毛忍冬乙醇提取物组(100、500、1000μg/mL的灰毡毛忍冬乙醇提取物添加20 mg/mL的D–半乳糖)、阳性对照组(50μg/mL的三七总皂苷添加20 mg/mL的D–半乳糖),按照试验分组,将细胞 在37℃、5%的CO_(2)培养箱中培养48 h,检测细胞 抑制率、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位(MMP)和线粒体活性氧(mtROS)水平,以及p53、p16、线粒体复合体基因、Bcl–2、Caspase–3的表达水平。结果表明:灰毡毛忍冬乙醇提取物中含有酚酸、黄酮、有机酸、萜类等大量活性物质;与对照组相比,模型组细胞 抑制率显著增加,细胞 数量显著减少,MMP下降,mtROS水平增加,SOD含量降低,MDA含量增加,线粒体复合体蛋白NDUFV1和抑凋亡蛋白Bcl–2明显下降,Caspase–3明显上升;与模型组相比较,灰毡毛忍冬乙醇提取物组和阳性对照组有效降低了细胞 抑制率,显著提高了细胞 数量和SOD活性,降低了MDA含量,提高MMP水平,降低mtROS含量,有效降低p53、p16、Caspase–3的蛋白水平,升高Bcl–2、NDUFV1的蛋白水平。说明在MEF细胞 中,灰毡毛忍冬乙醇提取物可通过增加线粒体复合体I蛋白富集和减缓细胞 凋亡来减弱D–半乳糖所诱导的氧化应激效应。 韩少凡 程满 王懿文 陈彦超 朱登峰 彭国平 饶力群 汪启明关键词:灰毡毛忍冬 乙醇提取物 小鼠胚胎成纤维细胞 线粒体 氧化应激 华泽兰根部乙酸乙酯萃取物基于NF-κB及NLR-P3炎症小体信号通路对NIH-3T3小鼠 胚胎 成 纤维细胞 功能的影响 被引量:2 2023年 目的探讨华泽兰乙酸乙酯萃取物对小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (NIH-3T3)功能的影响。方法从炎症因子一氧化氮(NO)及氧化应激重要因素活性氧(ROS)介入,通过核因子κB(NF-κB)及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLR-P3)炎症小体等信号通路角度阐明其作用机制。体外培养NIH-3T3细胞 ,分为空白对照组(Control)、不同浓度华泽兰根部乙酸乙酯萃取物组,检测不同浓度下华泽兰根部乙酸乙酯萃取物对NIH-3T3细胞 Toll增殖活性(MTT法)、细胞 迁移(细胞 划痕实验)、分泌NO及胞内ROS生成 的影响,Western blot法检测其对Toll样受体4(TLR-4)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、NLR-P3、NF-κB、髓样分化因子(Myd88)、核因子抑制蛋白α(IκBα)、白细胞 介素-18(IL-18)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、环氧化酶-2(COX-2)蛋白表达的影响。结果细胞 增殖与细胞 划痕实验表明,华泽兰根部乙酸乙酯萃取物对于NIH-3T3细胞 的增殖与划痕愈合影响具有双向性。与对照组相比在低浓度下(<6.25μg·mL^(-1)),萃取物有促进NIH-3T3细胞 增殖与迁移的作用,而高浓度(>25μg·mL^(-1))反而表现出对NIH-3T3细胞 的增殖与迁移抑制作用,且不同阶段呈现出相应的剂量依赖性,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。在萃取物浓度为6.25μg·mL^(-1)时,NO生成 量相较于低浓度组差异有显著统计学意义(P<0.01),而高浓度组(>12.5μg·mL^(-1))相较对照组差异无统计学意义(P>0.05)。细胞 内ROS生成 实验表明,经华泽兰根部乙酸乙酯萃取物处理后ROS生成 量显著高于对照组(P<0.05,P<0.01)。Western blot实验表明,与对照组相比,萃取物作用浓度为6.25μg·mL^(-1)时,细胞 内NF-κB、TLR-4、Myd88、NLR-P3、ASC表达显著升高(P<0.01),IκBα表达升高(P<0.05),IL-18表达显著降低(P<0.01),Caspase-3表达降低(P<0.05)。结论华泽兰乙酸乙酯萃取物对小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (NIH-3T3)增殖的影响具有� 杜冯 邹坤 黄文峰关键词:细胞功能 NF-ΚB 一种小鼠 胚胎 成 纤维细胞 恶性转化株及其应用 本发明公开了一种基于3D培养条件下温石棉诱导的小鼠 胚胎 成 纤维细胞 恶性转化株及其应用,属于生物学和肿瘤学技术领域。所述小鼠 胚胎 成 纤维细胞 恶性转化株分类命名为:小鼠 胚胎 成 纤维细胞 系NIH3T3/3As‑T,保藏号为:CCTC... 张芳芳 朱丽瑾 苑修源 张敏 肖芸 鞠莉 余珉 应士波 高雅楠Acvr1基因敲除小鼠 胚胎 成 纤维细胞 永生化细胞 系的建立 目的:ACVR1介导的信号通路在牙与骨等硬组织发育中发挥重要作用。本实验旨在建立Acvr1基因敲除小鼠 胚胎 成 纤维细胞 (MEF)永生化细胞 系,为深入研究ACVR1在牙与骨等硬组织发育中的作用机制提供实验材料。材料与方法:小... 周怡君 史册 孙宏晨关键词:永生化细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞 基因敲除