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三种大鼠椎间盘细胞提取、鉴定及在单层和微团培养中的基质表达: 2025年; 背景:目前获得椎间盘原代细胞的方法大多较繁琐,且缺少同时提取纤维环、终板与髓核原代细胞的相关报道,因此找到同时提取3种细胞的方法十分关键。目的:探索一种同时提取并培养大鼠来源3种椎间盘细胞(纤维环、终板与髓核)的方法,对之进行鉴定并探究单层与微团培养对细胞外基质的影响。方法:取材自3周龄雄性SD大鼠椎间盘组织,从其中分离出软骨终板、髓核与纤维环组织。针对髓核及纤维环组织,先使用0.1%链酶蛋白酶E于37℃消化30 min,然后使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h来释放其中的细胞;针对终板组织,直接使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h来释放其中的细胞。将去除消化酶后的细胞接种于含有培养基的培养皿中,并观察细胞形态;通过实时定量荧光PCR与蛋白印迹实验检测各细胞标记物的表达水平;单层或微团培养大鼠原代纤维环细胞与软骨终板细胞,并采用阿尔新蓝与番红染色检测细胞外基质的表达能力。结果与结论:①3种椎间盘细胞均在培养4 d后开始贴附在皿底,并逐渐展现出增殖的活力;培养至第8天时,3种细胞增殖显著,形态均呈梭形,其中髓核细胞中存在多囊泡的脊索样细胞;②通过实时定量荧光PCR和/或蛋白免疫印迹实验发现原代髓核细胞中K19与Car3表达较高,原代纤维环细胞中Sparc与Bgn表达较高,原代软骨终板细胞中Pth1r与Lars2表达较高;③原代纤维环、软骨终板细胞微团培养后,经阿尔新蓝与番红染色证明这种培养方式相较于单层培养能够提高细胞外基质的表达能力;④结果表明,通过此次实验方法提取并培养获得的原代椎间盘细胞形态较好并具有较高的胞外基质表达水平,这一成果有望为科研人员提供一种新的科研工具,帮助科研人员更好地理解椎间盘生物学。; 胡思远陈建权; 关键词：细胞鉴定微团培养

利用全胚胎和微团培养模型评价硝酸铈的发育毒性: 2021年; 目的:利用大鼠植入后全胚胎培养模型和微团培养模型模拟胚胎发育早期和中、晚期过程,评价硝酸铈的发育毒性,以期为进一步开展体内实验研究及合理制定人群稀土接触的健康指导值提供科学依据。方法:取孕9.5 d的SD大鼠胚胎,分别在含0.00、0.50、0.75、1.00 mmol/L硝酸铈的大鼠即刻离心血清中37℃旋转培养,48 h后根据Brown's评分法对胚胎的生长发育及形态功能进行评分,结合BALB/c 3T3细胞毒性结果,利用欧洲替代方法验证中心(ECVAM)全胚胎预测模型评价硝酸铈胚胎早期发育毒性。分离孕13 d的SD大鼠胚胎肢芽原代细胞进行微团培养,分别用0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00和3.00 mmol/L硝酸铈进行染毒,培养5 d后利用中性红活细胞摄取染色法测定50%细胞增殖受抑制时的浓度(IC50),利用阿利新蓝染色法测定50%细胞分化受抑制时的浓度(ID50),根据ECVAM微团培养预测模型评价硝酸铈胚胎中、晚期发育毒性。结果:全胚胎培养模型中硝酸铈对胚胎生长的无可见有害作用水平(NOAEL)为0.50 mmol/L,0.75 mmol/L以上浓度硝酸铈可显著降低胚胎卵黄囊直径和顶臀长(P<0.05),抑制胚胎生长,并可致胚胎体节数目减少(P<0.05),胚胎发育畸形。微团培养模型中硝酸铈对肢芽细胞增殖活性的NOAEL为0.25 mmol/L,对肢芽细胞分化为软骨细胞的NOAEL为0.12 mmol/L,其IC50和ID50分别为1.23和0.76 mmol/L。结论:经全胚胎培养预测模型和微团培养模型评价硝酸铈为弱发育毒性化学物。; 刘青云康陈萍肖倩倩郝卫东; 关键词：全胚胎培养微团培养发育毒性

应用微团培养和胚胎干细胞试验模型评价二硝酰胺铵的发育毒性: 2021年; 目的利用微团培养和胚胎干细胞试验评价二硝酰胺铵(ADN)潜在的胚胎发育毒性,并评估其是否为致畸物。方法于2018年9月,分离大鼠胚胎并收集肢芽细胞,使用不同浓度(0、312.50、625.00、1250.00、2500.00、5000.00、10000.00μg/ml)ADN进行染毒,计算细胞半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度并评价ADN致畸作用。在胚胎干细胞试验中,检测不同浓度(0、39.06、78.13、156.25、312.50、625.00、1250.00、2500.00μg/ml)ADN对小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化的抑制作用,以及对mESCs和3T3细胞的细胞毒性,并评价其胚胎毒性。以已知的强胚胎毒性药物5-氟尿嘧啶和非胚胎毒性药物青霉素-G为试验材料,对模型的有效性进行验证,并采用验证性试验模型评价ADN的胚胎毒性。结果微团培养试验中,各个浓度ADN组大鼠胚胎肢芽细胞增殖抑制率和分化抑制率均高于对照组(P<0.05);ADN对肢芽细胞的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为7480.32和4526.09μg/ml,判定ADN为非致畸物。胚胎干细胞试验中,各个浓度ADN组mESCs增殖抑制率高于对照组,156.25、312.50、625.00、1250.00、2500.00μg/ml ADN组3T3细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05)。ADN对mESCs的半数增殖抑制浓度和半数分化抑制浓度分别为1851.73、1796.39μg/ml,对3T3细胞的半数增殖抑制浓度为3334.35μg/ml,判定ADN为无胚胎毒性。结论经微团培养和胚胎干细胞试验模型评价,ADN无胚胎毒性,属于非致畸物。; 高俊宏王鸿范小琳刘志永赵彬高婷; 关键词：胚胎干细胞二硝酰胺铵微团培养发育毒性

利用全胚胎和微团培养模型评价硝酸镧的发育毒性被引量：4: 2020年; 目的:利用大鼠植入后全胚胎培养模型和微团培养模型评价硝酸镧潜在的胚胎早期和中、晚期发育毒性。方法:将大鼠胚胎随机分为5组后培养于含不同剂量硝酸镧(0、0.12、0.23、0.46及1 mmol/L)的即刻离心血清中,48 h后测量胚胎卵黄囊直径(YSD)、顶臀长(CRL)和头长(HL),计数体节,并根据Brown’s评分法对胚胎进行总形态学评分(TMS)。同时,对BALB/c 3T3细胞进行细胞毒性测试。根据欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的预测模型对硝酸镧的胚胎早期发育毒性进行评价。分离大鼠胚胎肢芽细胞,制成单细胞悬液,进行微团培养。分别用0.03、0.06、0.13、0.25、0.5、1、2及3 mmol/L硝酸镧进行染毒,利用中性红活细胞摄取染色法测定50%细胞增殖受抑制时的浓度(IC50)以反映细胞增殖情况,利用阿利新蓝染色法测定50%细胞分化受抑制时的浓度(ID50)以反映细胞分化情况。根据ECVAM预测模型对硝酸镧胚胎中晚期发育毒性进行评价。结果:硝酸镧对胚胎生长的无可见有害作用水平(NOAEL)为0.12 mmol/L,0.46 mmol/L硝酸镧可明显降低胚胎YSD、CRL和HL(P<0.05),对胚胎生长有明显的抑制效应。0.46mmol/L硝酸镧可诱导胚胎产生发育畸形,减少胚胎体节形成数目(P<0.05)。硝酸镧对肢芽细胞增殖活性的NOAEL为1 mmol/L,对肢芽细胞分化为软骨细胞的NOAEL为0.25 mmol/L,其IC50和ID50分别为1.57 mmol/L(510.25μg/mL)和0.99 mmol/L(321.75μg/mL)。结论:经全胚胎培养预测模型评价硝酸镧为弱胚胎发育毒性化学物;经微团培养模型评价硝酸镧为无胚胎发育毒性化学物。; 康陈萍刘青云肖倩倩郝卫东; 关键词：硝酸镧全胚胎培养微团培养发育毒性

二维及微团培养法对软骨细胞表型的影响被引量：2: 2016年; 目的探讨二维及微团培养对软骨细胞表型的影响。方法体外高密度二维及微团培养方法培养兔软骨细胞,从细胞形态、细胞外基质表达情况分析软骨细胞表型的差异。结果高密度二维方案培养兔软骨细胞,2周后软骨细胞多层分布,HE染色显示细胞呈圆形,细胞间联系较密,阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌较少;微团培养方法培养兔软骨细胞,2周后形成肉眼可见的白色组织,HE染色显示细胞呈多边形,细胞较分散,阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌明显多于二维培养,差异有统计学意义(P<0.05)。结论微团培养方法培养兔软骨细胞,有利于软骨细胞分泌细胞外基质。; 宋雄波吴江怡黄术陈诚杨柳刘宝荣; 关键词：软骨细胞微团培养

软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨被引量：4: 2014年; 背景:滑膜间充质干细胞在体外具有多向分化的能力,有望成为软骨组织工程中治疗软骨缺损的种子细胞,在其向软骨细胞分化过程中,合适的生长因子起了重要作用。目的:利用富含生长因子的软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化,并对其鉴定。方法:采用消化法分别获得SD大鼠滑膜间充质干细胞、软骨细胞。收集软骨细胞上清液离心、过滤冻存备用。培养滑膜间充质干细胞至第3代后离心成微团,并用软骨细胞上清液进行成软骨诱导分化,通过形态学观察、免疫组织化学法、RT-PCR检测进行鉴定。结果与结论:滑膜间充质干细胞使用软骨细胞上清液成软骨诱导21 d后,微团可见似软骨样组织。免疫组化法进行Ⅱ型胶原鉴定,基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。RT-PCR结果显示诱导后的微团表达软骨特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。证实软骨细胞分泌的可溶性因子可以诱导大鼠滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。; 邵博龚忠诚刘慧凌彬克热木尹小朋胡露露王冰宁晓婷林兆全; 关键词：干细胞滑膜间充质干细胞软骨形成软骨细胞

高密度微团培养法对人骨关节炎软骨细胞分化影响的实验研究被引量：3: 2014年; 目的探讨高密度微团(Micromass)的细胞培养方法对人骨关节炎软骨细胞终末期成熟分化的作用影响。方法临床获取人骨关节炎关节软骨组织,分离骨关节炎软骨细胞,分别进行低密度单层培养和高密度微团培养,隔日细胞换液1次。每2日倒置显微镜观察细胞形态的变化;碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测ALP的分泌;RT-PCT方法检测细胞内Col2、Aggrecan、ALP和MMP-13等因子mRNA的表达。结果人骨关节炎软骨细胞具有自发性向终末期成熟分化的特征,在相同时间点,Micromass培养的软骨细胞与低密度单层培养的细胞相比,更具有软骨细胞的形态特征;ALP染色显示,Micromass培养的细胞内ALP染色强度明显减弱;RT-PCT显示,Micromass培养的细胞内Col2和Aggrecan因子mRNA的表达显著提高(P<0.05);ALP和MMP-13因子mRNA的表达显著降低(P<0.05)。结论高密度微团培养法抑制人骨关节炎软骨细胞过快的成熟分化,更好的维持了细胞的软骨细胞表型。; 田野徐莹付勤; 关键词：骨关节炎软骨细胞

采用微团培养模型探讨染料木黄酮的发育毒性被引量：8: 2010年; 目的:利用大鼠胚胎肢芽和中脑细胞微团培养模型研究染料木黄酮(genistein,GEN)的发育毒性,并探讨其发育毒性机制。方法:实验分为不同浓度的GEN(0、0.94、1.875、3.75、7.5、15.0μg/ml)染毒组,受试物分别作用于培养大鼠胚胎肢芽细胞和中脑细胞微团,采用中性红摄取法检测GEN对细胞增殖的影响,采用阿利新蓝染色方法检测GEN对肢芽细胞分化的影响,采用图像处理分析方法检测GEN对中脑细胞分化的影响。计算细胞50%增殖抑制浓度(IC50_P)和50%分化抑制浓度(IC50_D)。用不同浓度的雌激素受体拮抗剂ICI182780(0.1,0.5,1μmol/L)分别预处理细胞后再加入GEN(7.5μg/ml),观察雌激素受体途径在GEN诱导的发育毒性中的作用。结果:GEN对肢芽细胞的IC5_0P和IC5_0D分别为5.4μg/ml和4.9μg/ml,GEN对中脑细胞的IC5_0P为6.2μg/ml,IC5_0D分别为7.1μg/ml(集落分化个数)或5.3μg/ml(集落分化面积)。IC5_0P/IC50_D的比值均接近1。在GEN7.5μg/ml染毒组,用ICI182780预处理细胞,不能改变GEN诱导的发育毒性作用。结论:根据Flint's和欧洲替代方法验证中心ECVAM致畸物判别标准,并结合人体实际可能接触水平,认为GEN为强致畸物,并且对人类存在可能的风险。其致畸作用可能主要通过细胞毒性发挥作用,不依赖于雌激素受体途径。; 肖杨刘然邢丽娜尚兰琴许雅君郝卫东; 关键词：染料木黄酮微团培养发育毒性雌激素受体

BMP-7诱导脂肪干细胞微团培养下成软骨能力的实验研究: 目的: 比较脂肪干细胞在BMP—7存在时平面培养和微团培养两种方式下诱导分化成软骨细胞的情况，探讨不同培养方式对脂肪干细胞成软骨能力的影响。寻求一种更好的促进脂肪干细胞成软骨分化的培养方式。方法: ...; 乔添柱; 关键词：脂肪干细胞骨形成蛋白7 微团培养诱导分化软骨细胞; 文献传递

应用生物反应器及体外微团培养构建骨软骨复合体修复关节软骨损伤的实验研究: 目的：关节软骨主要是由软骨细胞及其周围的外基质组成的无血管组织。关节软骨损伤是骨科的较为常见的疾患，其损伤后自我修复能力很弱，至今软骨缺损的修复仍无理想的方法。创伤、骨软骨炎、骨性关节炎、髌骨软化等均可引起软...; 吴帅; 关键词：骨软骨缺损微团培养生物反应器; 文献传递

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