目的:利用RNA干扰技术抑制大鼠成骨细胞核激活因子受体配体(Ligand of receptor activator of NF-κB,RANKL)的表达,观察成骨细胞RANKL/骨保护素(osteoprotegerin,OPG)比值变化,探讨成骨细胞与破骨细胞生成的相关性。方法:实验于2006-05/10在四川大学华西医院移植免疫实验室(国家重点实验室)完成。①实验材料:体外化学合成4条RANKL序列特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),用Lipofectin2000TM转染成骨细胞。②实验方法:采用荧光实时定量聚合酶链反应检测RANKL mRNA的表达,筛选出最有效的干扰序列。③实验分组:分为最有效的siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组,每组设5个平行样本。采用免疫组织化学染色检测成骨细胞中RANKL、OPG蛋白的表达,观察RANKL/OPG比值变化。④实验评估:采用成骨细胞、破骨细胞共培养技术观察以上3组转染后的成骨细胞对破骨细胞生成的影响。结果:①4种siRNA敲除RANKL基因后mRNA的表达:4种siRNA转染成骨细胞后,相对空白对照组,siRNA4分子对RANKLmRNA的抑制作用最为明显,达到89%。siRNA1,siRNA3对RANKLmRNA的抑制作用大于50%,而siRNA2对RANKLmRNA的也有相当的抑制作用。②各组成骨细胞中RANKL和OPG蛋白水平:RANKL和OPG的阳性表达均显示为棕黄色颗粒,RANKL主要分布于成骨细胞的胞浆和胞膜,OPG主要分布于成骨细胞的胞浆。siRNA4转染组RANKL表达(平均积分光密度值)低于空白对照组(分别为3.05±2.17,11.31±1.26),差异有显著性意义(P<0.01);阴性对照组与空白对照相比,差异无显著性意义(P>0.05)。siRNA4转染组、阴性对照组OPG表达与空白对照组比较,差异均无显著性意义(P>0.05)siRNA4转染组RANKL/OPG比值低于空白对照组(分别为0.12±0.03,0.45±0.04),差异有显著性意义(P<0.01)。③转染的成骨细胞对破骨细胞生成的影响:各组共培养形成的破骨细胞形态与分离的成熟破骨细胞相似,为不规则形,胞浆红染,
目的:对正常健康人群外周血液中骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)、核因子kappaB受体活化因子配体(receptor activator of NFκBligand,RANKL)浓度测定,明确其与年龄、性别之间是否存在一定关系。方法:收集220例正常健康人的清晨外周血液,其中男108例,女112例;年龄35～70岁,平均52.5岁。用ELISA法测血清中OPG、sRANKL浓度。结果:在35～70岁正常健康人群外周血液中的OPG、sRANKL浓度:女性,OPG21.95～315.47pg/ml,sRANKL10.25～370.20pmol/L;男性,OPG14.78～192.55pg/ml,sRANKL9.25～300.32pmol/L。46岁后女性血液中OPG浓度与年龄存在正相关;57岁后女性血液中sRANKL浓度明显升高。结论:年龄和性别影响外周血液中OPG、sRANKL浓度。46岁后女性血液中OPG浓度随年龄增加而升高,女性血液中sRANKL浓度57岁后明显升高。
