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融合蛋白ABD-Fc-IL-2的真核表达及其生物学活性鉴定: 2023年; 目的真核表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并检测其生物学活性。方法通过直接PCR及重叠延伸PCR法扩增目的基因SP-ABD-Fc-IL-2,连接至载体pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2。将重组质粒转染CHO-S细胞表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并进行Protein A beads亲和层析纯化。Western blot法检测纯化融合蛋白的特异性,CTLL-2/MTT细胞增殖比色法测定其生物学活性,pull down/Western blot法检测融合蛋白中链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(albumin-binding domain,ABD)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的相互作用。结果重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。纯化融合蛋白ABD-Fc-IL-2纯度达90%,可与鼠抗IL-2单克隆抗体发生特异性结合,生物学活性为3.29×108IU/mL,融合蛋白中ABD与HSA可相互结合。结论真核表达的融合蛋白ABD-Fc-IL-2具有较高的生物学活性,可促进CTLL-2细胞增殖,且保持了ABD片段与HSA结合的能力。; 柴欣秀张波王静娜孔道春郭睿; 关键词：真核表达生物学活性

猪重组RBP4蛋白可溶性原核表达纯化及生物学活性鉴定: 2023年; 视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein,RBP4)是一种主要在肝脏细胞和脂肪细胞中合成和分泌的细胞因子。RBP4在机体的脂肪代谢、慢性炎症、胰岛素抵抗等疾病过程中发挥重要作用,最新的研究也发现其与病毒感染密切相关。为了获得可溶性猪重组RBP4蛋白,本研究克隆了猪rbp4(prbp4)基因,并成功构建了原核表达载体pET32a-pRBP4。将该原核表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中,分别对诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度及超声功率进行条件优化,结果显示重组pRBP4以0.5 mmol/L IPTG在16℃条件下诱导12 h能够获得最大量的可溶性蛋白。进一步研究发现,以60 mmol/L咪唑纯化重组蛋白可获得最高产量。利用纯化的重组pRBP4蛋白处理猪肺泡巨噬细胞,qPCR检测炎症因子表达情况,发现重组pRBP4可显著诱导IL-1β、TNFα及IL-6的表达,表明获得的重组蛋白具有良好的生物学活性。以上结果为深入研究pRBP4的生物学功能提供了有利的生物学候选工具。; 赵鹤娇韩庆兵商营利; 关键词：视黄醇结合蛋白4 原核表达可溶性表达蛋白纯化

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定: 2022年; 为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.; 周向阳李仲凯郝腾飞丁光硕郑文慧李文娟; 关键词：SUMO 原核表达生物学活性

规模化制备高纯度牛奶外泌体工艺方法的建立及其分子与细胞生物学活性鉴定被引量：1: 2021年; 目的:建立一种规模化的牛奶外泌体纯化工艺,用于实验室制备和工业规模生产,并评价牛奶外泌体的分子与细胞生物学活性。方法:取市售多种全脂或脱脂牛奶,以外泌体提取金标准——超速离心法(UC)作为对照,采用多种化学前处理方法去除乳蛋白,切向流超滤技术(TFF)进一步去除残留的乳蛋白,并实现牛奶样品的初纯与浓缩,多模式色谱法(BE-SEC)精纯牛奶外泌体,采用纳米流式细胞术(NanoFCM)检测牛奶外泌体的粒径、颗粒浓度和纯度,透射电子显微镜(TEM)观察牛奶外泌体的形态表现,高效液相色谱(HPLC)验证牛奶外泌体的尺寸和纯度,Western blotting法检测牛奶外泌体特异性蛋白的表达,基因本体(GO)富集分析差异表达微小RNA(miRNA)的候选靶基因,DAVID Bioinformatics Resources 6.8和KOBAS软件检测京都基因和基因组百科(KEGG)通路中目标候选基因的统计富集度,CytoFlex流式细胞术检测细胞对牛奶外泌体的摄取情况,流式细胞术检测牛奶外泌体作用后Caco-2细胞凋亡率。结果:工艺研究,磷酸钠沉淀法在操作便利性、方法稳定性和产品质量方便均优于其他预处理方法。TFF法可进一步去除残留乳蛋白并可实现液体浓缩目的,有效衔接至下游BE-SEC精纯方法。以该三步工艺所得外泌体样品经TEM成像显示均呈典型的盘状或杯状外泌体形态。NanoFCM法检测的样品粒径为30~150 nm,且优于UC所得外泌体样本纯度。Western blotting法检测,确定外泌体样品含有CD81、Alix和TSG101等外泌体特异性标志物。SEC-HPLC分析,不同批次终产物均为单一均质峰,无游离蛋白污染。GO与和KEGG数据库分析,牛奶外泌体富含免疫相关蛋白与炎症反应调节信号通路相关miRNA。上述制备工艺所得外泌体具备高效穿透细胞膜的能力,4 h内入胞比例达99%。结论:建立了一套由化学沉淀前处理、TFF和BE-SEC三步结合的牛奶外泌体高纯度制备工艺方法�; 杨晶徐铭枝张东伟董亚楠王伊宋海峰; 关键词：外泌体牛奶

杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白的生物信息学分析、原核表达及生物学活性鉴定被引量：1: 2021年; 目的揭示杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白生物信息学特征,并探索该类蛋白外源表达方法及生物学活性。方法通过生物信息学软件对已获得的3个含HSP70结构域蛋白的理化性质进行分析,利用免疫表位数据库和分析资源(IEDB)对该类蛋白的T、B细胞表位进行预测;根据Uniprot数据库提供的氨基酸序列合成相关基因并克隆入pET28a(+)质粒进行原核表达,采用SDS-PAGE检测蛋白表达,表达产物经镍柱纯化后行Western blot鉴定目的蛋白;蛋白浓度定量试剂盒检测蛋白浓度后,分别以鉴定出的目的蛋白为抗原制备BALB/c小鼠哮喘模型,ELISA检测小鼠血清中IgE抗体浓度。结果经生物信息学分析B9N9W6、B9GX02及A0A2K2AYN8蛋白相对分子质量(Mr)分别为71 900、94 600和75 200,均为亲水性蛋白且稳定性较好;经在线预测,共鉴定出3种蛋白的高亲和力T细胞表位13个,B细胞表位14个;SDS-PAGE显示,B9N9W6蛋白、B9GX02蛋白及A0A2K2AYN8蛋白分别在约72 000、95 000和75 000处出现特异性条带,Western blot法也在相应位置出现特异性条带;ELISA检测显示,提取液组和A0A2K2AYN8组IgE表达水平高于PBS组;同A0A2K2AYN8组比较,B9N9W6组及B9GX02组IgE浓度显著增高。结论杨絮HSP70结构域蛋白A0A2K2AYN8、B9GX02及B9N9W6均可原核表达,为可溶性蛋白,且具有生成IgE的生物活性。; 郭伟郭伟湛孝东席贻龙; 关键词：生物信息学 IGE

重组人β-catenin原核表达条件的优化及生物学活性鉴定被引量：6: 2020年; 优化重组人β-catenin(138~686 aa)在大肠埃希菌中的原核表达条件,经分离纯化后进行生物学活性鉴定。利用基因工程技术,将构建的重组质粒β-catenin-pET-30a(+)转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后进行β-catenin原核表达。为了提高β-catenin表达量,从诱导时间、诱导温度与IPTG诱导浓度3个单因素方面进行原核表达条件优化。β-catenin经HisTrap层析柱分离纯化后,以荧光偏振实验和酶联免疫吸附测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行生物学活性鉴定。构建的工程菌经原核表达条件优化后,确定诱导温度25℃、诱导时间10 h、0.2 mmol/L IPTG作为β-catenin最佳原核表达条件。荧光偏振实验和ELISA实验说明,纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。本研究成功进行了重组人β-catenin原核表达条件的优化与生物学活性鉴定,为深入研究β-catenin在肿瘤免疫抵抗中的生物学功能奠定了实验基础。; 牛夏忆韩茂椿李淼陈云雨刘晓平; 关键词：Β-CATENIN 荧光偏振

重组建鲤Stefin的原核表达制备、生物学活性鉴定及其在建鲤组织中的表达分布: 本研究首先对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin进行原核表达及纯化;而后对其抑制活性特征进行初步鉴定;最后利用荧光定量PCR及免疫组化法对Stefin在建鲤不同组织中的mRNA、蛋白表达水平进行了分析。1.建鲤Stefi...; 白稚子; 关键词：建鲤原核表达; 文献传递

三种牛干扰素融合蛋白的制备及其生物学活性鉴定: 干扰素(Interferon，IFN)作为一种具有抗病毒和免疫调节作用的糖蛋白，常用于治疗和预防病毒性疾病，但干扰素的半衰期短，治疗疾病过程中需反复注射并且会伴随细胞毒性的副反应发生，这些劣势极大地限制了其在临床上的应用...; 程薪同; 关键词：融合蛋白长效干扰素生物学活性; 文献传递

重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定被引量：1: 2018年; [目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。; 邓学天毛海洲刘丹丹于淼于双营张守涛; 关键词：人肿瘤坏死因子Α 原核表达

人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性鉴定被引量：1: 2018年; 利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体(Anti-human ICAM-1 scFv)并进行生物学活性鉴定。应用TomlinsonI+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮"吸附-洗脱-扩增"进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验进行阳性克隆的鉴定。scFv经原核表达和分离纯化后,以Western blotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定。Tomlinson I+J噬菌体抗体库经4轮亲和富集筛选,利用ELISA方法成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。对scFv进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白。竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的scFv具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性。文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗ICAM-1 scFv,为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础。; 陈云雨孙红孙红胡华波张国利刘晓平岳玉环

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