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胞嘧啶单碱基编辑技术与λ-Red同源 重组 技术构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株的比较研究 被引量:3 2021年 由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。【目的】以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术(CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE)和λ-Red同源 重组 技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。【方法】采用PCR、GoldenGate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。【结果】经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。【结论】CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。 路娟娥 张彪 邓磊 刘素可 武陶 阮海华关键词:鼠伤寒沙门氏菌 基于Red同源 重组 技术构建N-乙酰葡萄糖胺发酵工程菌 被引量:1 2020年 N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是一种治疗骨关节炎、风湿性关节炎的有效药物。传统的GlcNAc生产方式费时费力且存在潜在过敏源,亟待开发低成本、环保高效的GlcNAc生产工艺。该研究首先利用Red同源 重组 技术将氨基葡萄糖合成酶(Glucosamine synthase,glmS)和氨基葡萄糖乙酰转移酶(Glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase 1,GNA1)整合至大肠杆菌基因组,构建GlcNAc诱导表达菌株。然后,进一步敲除man XYZ基因簇和nag DCABE基因簇,阻断GlcNAc胞内分解代谢途径。最后,考察副产物合成途径对GlcNAc产量的影响共构建了3株工程菌,分别为:单独敲除ldh A基因,阻断乳酸合成途径工程菌;单独敲除pta-ackA基因,阻断乙酸合成途径工程菌以及双基因敲除阻断乙酸、乳酸合成代谢途径工程菌。菌体生长曲线和GlcNAc发酵产量测定结果表明,单独敲除乙酸合成代谢途径工程菌生长速率减慢但GlcNAc产率最高,摇瓶发酵至72hGlcNAc产量达6 g/L。该研究利用Red同源 重组 技术构建GlcNAc合成途径、改造GlcNAc胞内分解代谢途径及副产物合成途径,成功构建GlcNAc发酵工程菌,为GlcNAc工业化发酵生产奠定了工作基础。 成珺玮 王苏妍 杨哲 尹鸿萍关键词:大肠杆菌 RED同源重组 发酵 乙酸 一种用于Red同源 重组 的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析 被引量:1 2018年 为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str^S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan^R),采用重叠延伸PCR方法将str^S基因和kan^R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组 载体为模板,以带有flgK基因同源 臂的引物扩增获得Placstr^S-kan^R打靶片段和Parastr^S-kan^R打靶片段,然后结合Red重组 技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组 技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组 筛选工具提供了依据。 刘金泽 刘云惠 余子豪 李永霞 王明晓 张远星 李统战 李倩文 余旭平关键词:RED重组 RPSL基因 基因敲除 应用RED 同源 重组 技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌 被引量:1 2015年 目的应用RED 同源 重组 技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组 菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED 系统将融合片段重组 入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组 菌(HB101LOG)。对重组 菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组 菌株构建正确;重组 大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组 菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED 系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组 菌株。 杨汐静 张建新 陈晓亭 汤炜 于思淼 刘伟 姚笛 吴志军 于立权 朱战波 崔玉东关键词:链球菌 大肠埃希菌 RED同源重组 Red同源 重组 技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用 被引量:8 2015年 近年来,大肠埃希菌一直是分子生物学和基因组学的重要研究对象。20世纪80年代以来,生物学家发展了一种新型分子生物学技术-基因敲除。大肠埃希菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源 重组 技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。本文简要综述了利用Red同源 重组 技术进行大肠埃希菌基因敲除的原理、策略及应用现状。 吴程华 严玉霖 高洪 谭锐 董骎关键词:大肠埃希菌 基因敲除 Red同源 重组 在大肠杆菌基因敲除中的应用 被引量:9 2013年 大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源 重组 技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源 重组 技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。 吕沈聪 赵颖颖 钟卫鸿关键词:大肠杆菌 RED同源重组 基因敲除 Red同源 重组 敲除nagE和manX对大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响 被引量:10 2012年 氨基葡萄糖(GlcN)又称氨基葡糖或葡糖胺,是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物,在医药和保健领域具有广泛应用。在前期研究中,我们构建了一株可高效合成GlcN和其乙酰化衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的重组 大肠肝菌Escherichia coli-glms-gna1(在下游提取过程中用弱酸进行脱乙酰化即可将GlcNAc转化为GlcN)。但研究发现,发酵过程中GlcN和GlcNAc能被转运至胞内作为碳源利用,导致胞外产量显著减少。为阻断胞外GlcN和GlcNAc向胞内的转运,利用Red同源 重组 技术将E.coli-glms-gna1的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子编码基因nagE和甘露糖磷酸转运子编码基因manX敲除,获得nagE基因敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE和nagE/manX基因双敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE-manX,并在7 L发酵罐上利用构建的工程菌进行GlcN和GlcNAc的发酵生产。实验结果表明:培养对照菌株E.coli-glms-gna1至12 h时GlcN产量达到最大值4.06 g/L,GlcNAc产量达到最大值41.46 g/L;而培养单基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE至12 h时GlcN产量达到最大值4.38 g/L(是对照菌株的1.08倍),GlcNAc产量达到最大值71.80 g/L(是对照菌株的1.7倍);培养双基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE-manX至10 h时GlcN产量达到最大值4.82 g/L(是对照菌株的1.2倍),GlcNAc产量达到最大值118.78 g/L(是对照菌株的2.86倍)。这表明nagE和manX基因的敲除可显著降低GlcN和GlcNAc向胞内的转运,进而提高其在胞外的积累。研究结果对最终实现GlcN的工业化生产具有一定的指导意义。 陈欣 刘龙 李江华 刘杰 堵国成 陈坚关键词:氨基葡萄糖 大肠埃希菌中λ-Red同源 重组 系统介导的trp和yfp基因融合表达的研究 2012年 目的为研究大肠埃希菌中色氨酸合成酶α亚基编码基因(trpA)的表达,利用λ-Red系统将trpA、黄色荧光蛋白基因(yfp)、氯霉素抗性编码基因(cat)融合片段敲入基因组中。方法将trpA、yfp、cat基因进行融合PCR,获得重组 片段,转化入MG1655菌株中,利用pKD46编码的λ-Red系统将片段重组 入基因组中,经PCR验证及测序鉴定正确后,荧光显微镜观察融合蛋白表达。结果成功获得trpA-yfp-cat重组 片段,转化入MG1655菌株中获得阳性克隆,经测序鉴定正确。荧光显微镜观察可见细菌胞质内弥散分布黄色荧光,表明trpA-yfp融合表达片段成功地在MG1655菌株中表达。结论运用λ-Red系统可将trpA-yfp融合片段敲入MG1655菌株基因组中原位替换trpA基因,通过观察YFP蛋白的表达间接反映trpA基因的表达,具有不改变trpA基因自身功能和细菌生长的优点,为进一步研究大肠埃希菌色氨酸合成途径奠定基础。 陈兴 姚玉峰 周爱萍 倪进婧关键词:融合PCR 黄色荧光蛋白 Red同源 重组 在大肠杆菌基因组修饰中的应用 被引量:5 2011年 Red同源 重组 技术发展迅速,已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰,在点突变、基因敲除、序列整合等方面发挥着重要作用。简要综述了Red同源 重组 的重组 机制和操作策略等研究进展,并介绍了Red同源 重组 在大肠杆菌基因组减小及多基因代谢途径优化方面的应用情况。 孙旭 周长林 方宏清关键词:RED同源重组 大肠杆菌 基因敲除 利用Red同源 重组 技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌 被引量:9 2010年 利用Red重组 技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源 重组 系统,通过第一次同源 重组 将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组 酶在FRT位点发生第二次同源 重组 ,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065L-苏氨酸的产量为5.55±0.51g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065L-苏氨酸产量为9.77±1.83g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065L-苏氨酸产量为8.65±1.42g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。 闫继爱 张雪 张芸 左佃光 陈宁 温廷益关键词:大肠杆菌 RED同源重组 基因敲除 L-苏氨酸 发酵
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方宏清 作品数:93 被引量:262 H指数:9 供职机构:安徽大学 研究主题:大肠杆菌 工程菌 毕赤酵母 RED同源重组 纯化 杨琦 作品数:49 被引量:56 H指数:4 供职机构:贵州大学动物科学学院 研究主题:鼠伤寒沙门菌 HFQ SRNA 沙门菌 靶基因 戴红梅 作品数:43 被引量:86 H指数:5 供职机构:军事医学科学院生物工程研究所 研究主题:大肠杆菌 重组人表皮生长因子 纯化 工程菌 RHEGF 周围 作品数:43 被引量:42 H指数:4 供职机构:军事医学科学院生物工程研究所 研究主题:H7 大肠杆菌O157 大肠杆菌O157:H7 RED同源重组 分泌系统 张惟材 作品数:107 被引量:390 H指数:11 供职机构:北京生物工程研究所 研究主题:吡咯喹啉醌 古龙酸 山梨糖脱氢酶 乙内酰脲酶 甲基营养菌