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锡林高娃
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- 所属机构:内蒙古民族大学
- 所在地区:内蒙古 通辽市
- 研究方向:农业科学
- 发文基金:国家自然科学基金
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- 目的构建无乳链球菌菌毛岛屿辅助蛋白AP1、菌毛骨架蛋白BP主要抗原域串联表达重组载体,对表达产物进行抗原性分析及鉴定。方法利用DNAstar Protean功能筛选AP1和BP主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、BP主要抗原决定簇基因区,PCR扩增串联体基因片段,克隆至pET-30a(+)载体后转化BL21(DE3)细胞,表达的目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。结果 PCR扩增出321bp的AP1和660bp的BP主要抗原域,经重叠延伸PCR获得966bp的AP1、BP串联体基因片段,DNA测序表明无碱基缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经IPTG诱导能可溶性表达分子质量约45ku的目的蛋白,纯化后重组蛋白的纯度≥95%,Western blot分析表明,重组融合蛋白能被兔源抗无乳链球菌阳性血清识别。结论重叠延伸PCR获得AP1、BP主要抗原域串联体,构建的pET-30a(+)/AP1+BP重组表达载体能以包涵体形式表达目的蛋白,表达产物具有良好的反应原性,为研究基于AP1、BP蛋白的致病机制及其免疫活性奠定了实验基础。
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