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国家自然科学基金(30270072): 作品数：15 被引量：104H指数：6; 相关作者：王洪海谢建平乐军胡昌华魏麟更多>>; 相关机构：复旦大学上海市肺科医院西南大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划教育部科学技术研究重点项目更多>>; 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>

结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及酶学性质研究被引量：4: 2005年; 目的获得具有生物学活性的结核分枝杆菌重组异柠檬酸裂解酶蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因ic l,克隆入原核表达载体pET-28 a(+)中,通过在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白,并对其酶学性质进行测定分析。结果纯化出具有生物学活性的重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶。酶学性质测定分析表明,重组异柠檬酸裂解酶ICL的比活力为7.657×102μmol.mg-1.m in-1,反应最适pH值约为7.4。重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定,测得相对分子质量为50 603.347。在5 mmol/L Tris-C l缓冲液、pH值7.8、25℃条件下,重组ICL的二级结构中相对有43.8%的α螺旋、31.9%的β折叠、3.4%β转角、20.9%无规则卷曲。结论本研究成功克隆表达结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因,酶学性质鉴定获得了具有生物学活性的重组蛋白,为该酶免疫学研究及新型抗结核药物的筛选奠定了基础。; 郝方裴秀英张雪莲张顺宝赖煦卉王洪海; 关键词：基因表达

结核分枝杆菌感染人源树突状细胞的蛋白质表达谱被引量：9: 2005年; 在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的感染中,树突状细胞(Dendriticcells ,DCs)的应答反应是机体起始免疫应答的关键。因此,利用双向电泳技术(Two_dimensionalelectrophoresis,2_DE)对人源树突状细胞受结核分枝杆菌H37RvATCC 2 72 94菌株感染前后的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中产生差异的有4 5个蛋白质斑点,利用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱技术对其中4个表达明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得4个明确的肽指纹图谱,通过在数据库中检索分析,确定这4个蛋白质分别为人亚砷酸诱导ATP酶I(HumanArsenite_stimulatedATPase ,hASNA_I) ,膜联蛋白IV(AnnexinIV) ,γ_肌动蛋白(γ_actin) ,热休克蛋白2 7(Heatshockprotein2 7,HSP2 7)。上述发现有助于了解结核分枝杆菌入侵早期导致的树突状细胞蛋白质组表达变化,为深入研究结核分枝杆菌; 包佳玲乐军田野苹杨燕萍王洪海刘丽蓉闵彦; 关键词：树突状细胞结核分枝杆菌蛋白质组双向电泳

树突状细胞在抗结核分枝杆菌感染中的作用: 2005年; 树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是最有效的抗原呈递细胞。DCs能够摄取外来物质,包括结核分枝杆菌(Mycobac teriumtu berculosis,MTB),并将其呈递给效应性淋巴细胞,激发宿主对抗病原微生物感染的免疫反应。因此,树突状细胞与结核分枝杆菌的相互作用在感染初期机体发动免疫应答中十分重要。研究树突状细胞和结核分枝杆菌间的相互作用,有利于从根本上了解细菌-宿主作用机理,为阐明结核分枝杆菌逃避免疫的机制提供依据。; 包佳玲杨燕萍谢建平王洪海; 关键词：树突状细胞结核分枝杆菌免疫应答

猫爪草提取物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标被引量：18: 2006年; 利用双向电泳技术,对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱.通过数据库检索,确定这5个蛋白质分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶、烯酰-CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60 kD的分子伴侣2.其中前4个分子是首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动.该结果有助于了解猫爪草提取物对结核分枝杆菌生理的影响,为进一步确定中药猫爪草提取物对结核分枝杆菌的作用靶标和机理提供了基础.; 谢建平何颖乐军胡昌华王洪海唐翠魏秀莉梁莉刘雪梅宋洁; 关键词：猫爪草结核分枝杆菌 S-腺苷甲硫氨酸合成酶

大河乌猪血浆胆固醇脂转移蛋白基因多态性与生产性能的相关性分析被引量：1: 2013年; 试验应用PCR-RFLP技术对云南培育品种大河乌猪4代(F4)、5代(F5)和6代(F6))共334头个体的血浆胆固醇脂转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)基因内含子1436bp进行扩增,用限制性内切酶AvaⅡ对其酶切可得到3种基因型:BB、Bb和bb,F4、F5、F6都以b等位基因为优势等位基因,其等位基因频率分别为0.5821、0.6042和0.6885。取不同基因型纯合子样品进行测序,共发现7个单核苷酸多态位点(SNPs),其有3个为转换,4个突变为颠换,多态位点分别位于19、69、132、175、203、224、234bp处。应用最小二乘分析不同基因型和不同性别的基因型对生长性状(初生重、45日龄重、4月龄体重、6月龄体重、体高、体长、管围、背膘厚)的影响。结果显示,F4代Bb和bb基因型个体体长显著高于BB基因型(P<0.05);bb基因型6月龄管围显著高于BB基因型(P<0.05),与Bb基因型个体间差异不显著(P>0.05);F5代Bb和bb基因型个体初生重显著高于BB基因型(P<0.05),两者之间差异不显著(P>0.05);F6代bb基因型个体初生重、45日龄重显著高于BB基因型(P<0.05),与Bb基因型个体间差异不显著(P>0.05);其余性状不同基因型间无显著差异(P>0.05)。另外,bb基因型雄性和雌性个体在初生重都存在显著差异(P<0.05)。研究结果提示,CETP基因对猪生长性状(特别是初生重)存在一定影响;选择带有b等位基因的个体有望提高猪体质量相关的生长性状,该SNP可能是改良猪生长速度性状的重要分子标记位点。; 李福泉杨文郭斌霍金龙史宪伟; 关键词：大河乌猪 PCR-RFLP

抗结核一线药物及其主要作用靶点的突变被引量：10: 2005年; 张顺宝张雪莲郝方王洪海; 关键词：结核分枝杆菌一线药物

分枝杆菌噬菌体整合及裂解的分子机理: 2005年; 结核病仍旧威胁着全球人类健康,中国是结核病高发国家之一,寻求新的药物和疫苗势在必行。随着对噬菌体研究的深入,分枝杆菌噬菌体成为结核病新型药物发现和药敏实验的研究热点之一。噬菌体进入宿主菌体内,以裂解和溶源两种途径进入循环。以分枝杆菌的溶源性噬菌体为例,综述了分枝杆菌噬菌体整合和裂解分子机理。分枝杆菌溶源性噬菌体的整合需噬菌体基因组的附着位点attachment site(attP),宿主菌分枝杆菌基因组的附着位点attachment site(attB),整合酶integrase(Int)和整合宿主因子integration host factor(mIHF)。部分溶源性噬菌体如Ms6进入裂解循环,复制转录组装成新的子代噬菌体,在裂解素(Lysin)和穿孔素(Holin)的协同作用下裂解宿主菌,释放子代噬菌体。目前国内未见对分枝杆菌噬菌体的研究报道。研究分枝杆菌噬菌体整合及裂解机理对结核病治疗新药开发有一定的启示。; 申严杰胡昌华王洪海谢建平; 关键词：分枝杆菌噬菌体裂解

结核分枝杆菌泛酸激酶的克隆表达及酶学性质被引量：4: 2006年; 目的:获得具有生物学活性的结核分枝杆菌(Mtb)重组泛酸激酶蛋白.方法:以结核分枝杆菌模式菌株H37Rv基因组为模板,扩增泛酸激酶基因CoaA(Rv1092c),克隆入原核表达载体pET28a中,重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达.在优化后的诱导条件(20℃,10h,0.5mmol/LIPTG)下,收集细菌进行超声破碎,低温高速离心,得到的上清液经镍离子螯合型亲和层析柱纯化重组蛋白.高效液相色谱及质谱鉴定重组蛋白.采用酶联法测定重组蛋白的酶学性质.结果:得到了高表达、高纯度的重组结核分枝杆菌的泛酸激酶,酶催化过程中对泛酸的kcat和Km值分别为273.81kat/L,35.27μmol/L;对ATP的kcat和Km值分别为169.10kat/L,94.43μmol/L.重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定,测得Mr约为39168.在5mmol/LTris-HCl缓冲液,pH值7.5,25℃条件下,重组CoaA的二级结构中有39.3%α螺旋,13.7%β折叠,14.3%β转角,32.5%无规则卷曲.结论:成功克隆表达结核分枝杆菌泛酸激酶,酶学性质和二级结构鉴定表明重组泛酸激酶折叠正确,且具有生物学活性,为基于该酶筛选新型抗结核药物奠定了基础.; 张鹭王庆忠徐颖陈嘉臻路福平王洪海; 关键词：结核分支杆菌基因表达

结核分支杆菌H_(37)Rv莽草酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质的研究被引量：3: 2004年; 以结核分支杆菌H3 7Rv基因组为模板 ,扩增了该菌株的莽草酸脱氢酶基因aroE ,通过在大肠杆菌BL2 1(DE3) pLYS中表达 ,纯化出可溶性的重组结核分支杆菌莽草酸脱氢酶 (SD) .对其酶学性质测定分析表明 :在辅酶NADPH作用下该酶可催化还原 3 脱氢莽草酸生成莽草酸 ,最适pH值为 11,最适温度为 6 3℃ ,比活性 8.2 6× 10 4U/mg .Mg2 + ,Ni2 + ,Zn2 + 等金属离子及NP4 0、TritonX 10 0等变性剂对其酶活有一定的促进作用 ,而SDS则强烈抑制该酶活性 .应用圆二色仪初步测定了重组蛋白的二级结构 ,重组SD的二级结构中大约有 2 9.2 %的α螺旋 ,9.3% β折叠 ,32 .7% β转角 ,2 8.8%无规卷曲 .结核分支杆菌H3 7Rv莽草酸脱氢酶基因的克隆 ,为该酶的晶体结构分析、免疫学研究及抗结核药物靶点的筛选奠定基础 .; 于海东张雪莲王宝林雷建强曹健淳于利娟许云敏王洪海

结核杆菌诱导人巨噬细胞肿瘤坏死因子受体相关信号传导元件的表达谱被引量：4: 2003年; 目的　调查人巨噬细胞肿瘤坏死因子受体 (TNFR)相关信号传导元件在结核分枝杆菌入侵前后的转录水平和变化幅度。方法　利用含有 12 80 0个基因和 192 0 0个基因全长序列或部分序列的基因芯片研究结核分枝杆菌无毒株和有毒株入侵导致的人巨噬细胞U937全基因组在转录水平的表达谱变化的基础上 ,然后 ,在Northern验证的基础上 ,通过生物信息学分析TNFR相关信号传导元件的表达。结果　结核分枝杆菌无毒株入侵导致的人巨噬细胞U937中与TNFR有关的表达变化不如有毒株的明显 ,TNFR被抑制 ,与TNFR相关的下游基因的表达没有检测到。有毒株导致的变化比较明显 ,MAP激酶 ,NF kappaB ,caspase ,p5 3途径等下游元件的表达分别提高 2～ 3倍 ,内源TNF表达上升 2～ 4倍 ,TNF的转换酶disintegrin金属蛋白酶表达上升 2倍。结论　TNFR相关的信号传导途径元件参与了宿主对细菌的免疫反应 ,这些基因在转录水平被调控。结核分枝杆菌有毒株比无毒株激发的基因表达变化大。造成这种差异的原因有待进一步分析。; 谢建平李瑶乐军徐永忠梁莉于善谦王洪海; 关键词：结核杆菌巨噬细胞肿瘤坏死因子受体信号传导生物信息学

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