国家自然科学基金(30270061)
- 作品数：6 被引量：41H指数：4
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- 副黏病毒F蛋白融合活性位点中病毒特异性氨基酸基因突变分析
- 2009年
- 目的了解副黏病毒融合蛋白（F）融合活性位点中的病毒特异性氨基酸在细胞融合中的作用。方法以新城疫病毒（NDV）和人副流感病毒（hPlV）为例，在已确定的F蛋白融合活性位点中对病毒特异性氨基酸进行定点突变，然后将突变体F基因与同源或异源的血凝素-神经氨酸酶（HN）基因共转染BHK21细胞后，在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能，荧光强度分析（FACS）检测F蛋白的表达效率。结果在NDVF的突变体中，N150D—L152D的融合功能达到野毒株的46．31％；而N257D—N258D—Q259E、G271D—N272D和Q279E—Q281E的融合活性却几乎消失，分别只有野毒株的1．25％、3．14％和2．23％；N296D—N297D的融合功能是野毒株的97．68％。在hPIVF的突变体中，D143A－E145A的融合功能达到野毒株的32．63％；E223Q—K224A几乎不能形成合胞体，其融合活性只有野毒株的1．91％：K263A—R265A、D268A—D270A和R475A—R476A的融合功能分别是野毒株的14．63％、19．52％和28．95％。FACS结果表明，NDVF的N257D—N258D－Q259E、G271D—N272D和Q279E—Q281E突变体及hPIVF的E223Q—K224A突变体F蛋白在细胞表面几乎没有表达；其余所有突变体F蛋白的表达效率与野毒株相比，基本不变。结论对于NDVF来说，N257、N258、Q259、G271、N272、Q279、Q281对NDVF的特异性细胞融合功能起重要作用；N150和L152也起一定的作用，但是N296和N297却没有作用。对于hPIVF来说，E223和K224对hPIVF的特异性细胞融合功能起非常重要的作用；D143、E145、K263、11265、D268、D270、R475、R476的作用也很重要。
- 柴相君任桂芳潘新良任桂杰王志玉
- 关键词：副黏病毒融合蛋白活性位点基因突变
- 新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析被引量：10
- 2006年
- 为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。
- 王志玉任桂杰温红玲宋艳艳王桂亭姚苹许洪芝张文强
- 关键词：副粘病毒融合蛋白细胞融合基因新城疫病毒
- 副粘病毒F蛋白HR1和HR2在特异性膜融合中的作用被引量：5
- 2005年
- 目的了解副粘病毒融合蛋白(F)分子上的七肽重复序列(HR1、HR2)在特异性膜融合中的作用。方法采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F与人副流感病毒(hPIV)F基因上创造相同的酶切位点。酶切后采用基因重组方法将F的HR1基因片段相互交换,得到交换HR1的两个嵌合体(chimera),即NDV C-HR1和hPIV C-HR1。用同样的方法又得到交换HR2的两个嵌合体,即NDV C-HR2和hPIV C-HR2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN DNA共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果交换HR1后,NDV C-HR1的融合功能只有野毒株的53.91%,hPIV C-HR1的融合功能达到野毒株的83.15%;交换HR2后,NDV C-HR2的融合功能略高于野毒株,达到野毒株的107.23%,hPIV C-HR2的融合功能却只有野毒株的12.01%。FACS分析表明,交换HR1后的NDV C-HR1和hPIVC-HR1的表达效率均下降。交换HR2后,NDV C-HR2的表达效率没有改变,而hPIV C-HR2的表达效率下降。结论NDV F的HR1对其特异性膜融合具有重要作用,而HR2则没有病毒特异性;hPIV F的HR1和HR2对hPIV的特异性膜融合都有重要作用。
- 任桂杰王志玉李士保王桂亭宋艳艳许洪芝温红玲
- 关键词：副粘病毒F蛋白HR
- PCR介导的定点突变与随机突变的应用被引量：4
- 2005年
- 任桂杰王志玉
- 关键词：聚合酶链反应定点突变随机突变
- 副粘病毒F1蛋白胞外非保守区对其特异性膜融合的影响被引量：2
- 2005年
- 为了解融合蛋白F1分子的胞外非保守区在融合蛋白(F)与血凝素-神经氨酸酶(HN)的特异性膜融合中的作用,采用基因定点突变方法,在新城疫病毒(NDV)F1与人副流感病毒(hPIV)F1基因的胞外非保守区进行定点突变,创造酶切位点,得到分别含3个相同酶切位点的突变株NDV-M和hPIV-M。经检测,突变体的细胞融合功能与野毒株相同。然后用3个限制性内切酶分别从NDV-M与hPIV-M中切出两个片段NDVF-1、F-2及hPIVF-1、F-2。NDV-M和hPIV-M相互交换对应的F-1片段后进行基因重组,得到2个嵌合体(Chimera),即NDV-C1和hPIV-C1;同样方法交换F-2片段后又得到2个嵌合体NDV-C2和hPIV-C2。将各种嵌合体DNA与同源及异源HN基因共转染BHK21细胞后,在真核细胞中表达。Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测F蛋白的表达效率。结果表明,突变体NDV-M和hPIV-M的细胞融合功能与野毒株相同,可用于构建嵌合体。NDV-C1和NDV-C2分别与NDVHN共表达后,融合功能达到野毒株的76.34%和96.2%,与hPIVHN共表达后均无细胞融合发生;hPIV-C1和hPIV-C2分别与hPIVHN共表达后,融合功能达到野毒株的65.82%和93.78%,与NDVHN共表达后无细胞融合发生。FACS分析表明,突变体及所有嵌合体蛋白F的表达效率与野毒株相比均没有明显变化。实验结果说明在F1蛋白的胞外非保守区中,NDVF-1和hPIVF-1这两个片段对于NDV和hPIV的特异性膜融合具有重要作用;而NDVF-2和hPIVF-2这两个片段对于NDV和hPIV的膜融合来讲,则特异性较低。
- 任桂杰王志玉王桂亭宋艳艳许洪芝温红玲
- 关键词：副粘病毒融合蛋白
- 副粘病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展被引量：22
- 2005年
- 任桂杰王志玉
- 关键词：副粘病毒包膜糖蛋白分子生物学F蛋白HN蛋白
