国家自然科学基金(30200011)
- 作品数：17 被引量：165H指数：8
- 相关作者：陈焕春何启盖刘正飞吴斌贝为成更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 胸膜肺炎放线杆菌基因分型方法的建立及其临床应用被引量：9
- 2004年
- 根据胸膜肺炎放线杆菌各血清型之间外毒素 (Apx) ,外膜脂蛋白 (OmlA) ,转铁蛋白B(TbpB)的基因差异 ,分别对各血清型进行PCR扩增 ,得到不同的特异性片段 ,可区分开生物Ⅰ型 13个标准菌株血清型中的 8个血清型。临床检测结果与血清学分型一致 ,将此分型系统用于临床送检的 12 6份肺脏和 4 2份扁桃体的病原学检测 ,可直接检测出胸膜肺炎放线杆菌感染。此方法还可以将一些尚未定型的菌株进行归类 ,弥补了血清学方法的不足 ,为细菌的流行病学调查提供了可靠的技术手段。
- 陈凡陈美玲陈焕春何启盖PatBlackall
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌PCR基因分型病原学检测
- 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用被引量：8
- 2005年
- 将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素 基因的质粒 p ET- Apx 转化到大肠杆菌 BL2 1 (DE3)。挑选出表达量最高的克隆子 ,于 37℃经 IPTG诱导表达。对表达条件进行优化 ,并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原 ,建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接 EL ISA。试验的最佳反应条件为 :最佳抗原稀释度为 1∶ 1 6 0 ,抗原包被液用 Tris- HCl(p H8.0 ) ,封闭液用含 0 .4 %BSA的 PBST,血清稀释度为 1∶ 4 0 ,二抗稀释度为 1∶ 6 0 0 0 ,稀释液用含0 .4 %BSA的 PBST,血清反应时间为 30 min,二抗反应时间为 4 5 min,底物反应时间为 2 0 m in。与间接血凝 (IHA)检测结果比较 ,建立的 EL ISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性 ,并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接EL ISA对 2 5 0 3份临床送检血清进行了血清流行病学调查 ,结果表明 ,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为 6 3%。
- 梁望旺何启盖刘正飞陈焕春吴斌徐晓娟李涛
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌毒素间接ELISA
- 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立被引量：23
- 2004年
- 根据胸膜肺炎放线杆菌S4 0 74菌株毒素I的序列 ,设计了 1对引物 ,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I的结构基因 (apxICA) ,扩增的DNA片段大小为 36 4 0bp(4 6 87～ 832 6bp) ,将其克隆到pMD18 T载体中 ,酶切鉴定和序列测定后 ,进一步将其插入pET 2 8a中构建了原核表达载体 ,SDS PAGE和Westernblotting分析表明 ,该基因在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中获得了表达 ,而且表达的蛋白质具有免疫学活性。利用表达的蛋白作为抗原包被酶标板 ,建立了检测毒素I血清抗体的ELISA方法。临床应用表明 。
- 刘建杰何启盖陈焕春吴斌徐晓娟刘军发唐先春贝为成
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌毒素ELISA检测
- 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC^-/ GFP^+的构建及其生物学特性研究被引量：4
- 2004年
- 通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB0 3染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC- GFP+ ,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。
- 贝为成何启盖方六荣肖少波刘丽娜洪文洲刘正飞陈焕春
- 关键词：传染性胸膜肺炎放线杆菌突变株
- 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅲ A基因的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达
- 2007年
- 应用PCR方法扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinabacillus pleuropneumoniae,App)编码毒素A结构蛋白的完整基因,连接到载体pMD18-T中,经Not和Snab双酶切后连接到用同样酶切的表达载体pPIC9k上,转化GS115酵母感受态细胞,经甲醇诱导表达了分泌到胞外的Apx A蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白约为110 000,与预期相符。Dot-blot和ELISA检测结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。为进一步研究Apx A蛋白的结构和功能,研制App重组诊断抗原或亚单位疫苗奠定了基础。
- 汪招雄何启盖刘军发刘正飞陈焕春
- 关键词：PICHIAPASTORIS分泌表达
- 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：12
- 2003年
- 因胸膜肺炎放线杆菌的致病性主要是由毒素决定的 ,故参照猪胸膜肺炎放线杆血清2型菌株的序列 (GenBankL1 2 1 4 5)设计了一对特异性引物 ,用PCR的方法扩增apxⅢA基因并得到了长 3 466bp的片段 ,然后将其克隆到pMD 1 8T中 ,经酶切鉴定和序列分析表明克隆是成功的 ;再将apxⅢA插入到原核表达载体pET 2 8b后 ,转化BL2 1 (DE3) ,在IPTG诱导下获得高效表达 ,经Westernblotting检测证实表达产物有活性。以表达产物包被ELISA板 ,建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。
- 陈汉阳刘军发何启盖肖少波陈焕春
- 关键词：胸膜肺炎放线杆菌克隆原核表达
- 胸膜肺炎放线杆菌生物Ⅰ型标准抗血清的制备及初步临床应用被引量：5
- 2004年
- 用十三种血清型的胸膜肺炎放线杆菌标准菌株免疫家兔,制备了标准抗血清,通过玻片凝集试验,琼脂扩散试验和免疫电泳试验,对抗血清的特异性、效价和保存期进行了监测,结果表明,制备的抗血清有较好的特异性,在4℃可以保存一个月、-20℃和、-80℃下保存一年无明显变化。用抗血清对从湖南,安徽,河南等地分离的胸膜肺炎菌株进行分型鉴定,分别为血清2,3,8型;而PCR检测均为阳性,说明抗血清可用于野生株的鉴定和流行病学调查。
- 陈凡何启盖陈焕春刘正飞张震亚张迎Ross BowlePat Blackall
- 关键词：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗血清血清分型
- 副猪嗜血杆菌研究进展被引量：82
- 2003年
- 近年来 ,国内外许多猪场出现了一种以多发性浆膜炎和关节炎及高死亡率为特征 ,严重危害仔猪和青年猪的传染病。经细菌分离培养、生化鉴定和分子生物学试验证明 ,该传染病主要是由副猪嗜血杆菌所引起。为了更加全面地认识该病原体 ,文章对其流性病学、理化特性、分子生物学、诊断及防制作了较为全面的概述。
- 刘正飞蔡旭旺陈焕春吴斌何启盖
- 关键词：副猪嗜血杆菌多发性浆膜炎关节炎病原体疫苗分子生物学
- 猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖基因的原核表达及其产物的细胞毒性被引量：1
- 2005年
- 参考GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)血清2型荚膜多糖基因的序列分别设计了3对特异性引物,通过PCR分别扩增了CpsA、CpsB、CpsC 3个基因,获得长约1 137、429、1 146 bp的片段,将其分别克隆到pMD 18-T中,经酶切鉴定和序列分析获得了阳性克隆子;再将CpsA、CpsB、CpsC分别插入原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21,在IPTG诱导下获得高效表达,经Western-blotting检测证实,表达产物CpsC有生物学活性,CpsA、CpsB无活性;将3种表达产物等量混合,做10倍递进稀释后,与分离出的猪嗜中性粒细胞作用,37℃5、0 mL/L CO2培养箱中温育4 h后加入底物液,测定D492 nm值。结果表明,App荚膜多糖对猪嗜中性粒细胞无毒性作用。
- 刘丽娜何启盖陈焕春刘正飞贝为成
- 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌克隆细胞毒性试验
- 猪传染性胸膜肺炎新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究被引量：16
- 2005年
- 利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ,提取表达产物包涵体,再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌,和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗,免疫 BALB/c小鼠,间隔 2 周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的ELISA抗体和7型菌的血凝抗体,第2 次免疫 2 周后用 5LD50的猪胸膜肺炎放线杆菌1型、7型菌株进行攻毒。结果发现第2次免疫后抗体水平显著升高,用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为83.3%和91.7%,从死亡小鼠的体内分离到了攻毒菌株,初步的动物试验表明此种新型亚单位菌苗对同型和异型的APP菌株具有较好的保护力,为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。
- 刘建杰陈焕春何启盖吴斌李冲徐晓娟陈汉阳
- 关键词：小鼠免疫后保护力加强免疫猪胸膜肺炎放线杆菌猪传染性胸膜肺炎
