国家自然科学基金(81170533)
- 作品数：11 被引量：30H指数：4
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- 17β-雌二醇通过上调CXCR4表达促进骨髓间充质干细胞的趋化迁移被引量：4
- 2014年
- 目的研究17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)对体外骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)趋化因子受体CXCR4表达的影响及CXCR4表达变化对BMSCs趋化迁移的调控情况。方法全骨髓法+贴壁法分离、培养BMSCs,不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7、5×10-7、10-6mol/L)的17β-雌二醇诱导经雌激素受体拮抗剂ICI182780处理和未经处理的BMSCs后于不同时相点(24、48 h),用RT-PCR法和Western blot法分别检测细胞趋化因子受体CXCR4的表达情况,利用Transwell小室体外迁移体系观察10-7mol/L 17β-雌二醇诱导前后的BMSCs对于不同浓度基质细胞衍生因子SDF-1的定向迁移情况,及采用AMD3100阻断SDF-1特异性受体CXCR4后对雌激素诱导前后BMSCs定向迁移的影响。结果 BMSCs在不同浓度17β-雌二醇诱导24、48 h后,其CXCR4 mRNA的表达均有不同程度的升高,其中以24 h时10-7mol/L组升高最为明显(P<0.05)。CXCR4蛋白表达在24 h各浓度组以升高为主,24 h时5×10-7mol/L组升高最为明显,48 h各浓度组以降低为主。雌激素受体拮抗剂ICI 182780能够明显抑制17β-雌二醇对CXCR4表达的影响(P<0.05)。BMSCs对SDF-1的定向迁移有明显的浓度依赖性,且相同条件下17β-雌二醇诱导后的BMSCs迁移细胞数显著高于未经诱导的BMSCs,而CXCR4阻断剂AMD3100可明显抑制17β-雌二醇干预前后BMSCs的趋化迁移(P<0.05)。结论 17β-雌二醇在一定的诱导时间内可提高BMSCs CXCR4的表达,进而增强SDF-1对BMSCs的体外趋化作用。
- 孙欣慰杨铧琦徐惠成
- 关键词：雌激素骨髓间充质干细胞SDF-1
- 利用荧光素酶报告基因在体观察移植的人胚胎干细胞的动向
- 2013年
- 目的利用慢病毒载体携带荧光素酶报告基因并转导人胚胎干细胞,以实现在体观察移植细胞的增殖情况。方法酶切pGL3 base质粒获得荧光素酶基因序列,酶切LTBR-GIP获得载体骨架,经过酶切产物热失活、平末端处理、CIP处理、胶纯化和连接,所构建慢病毒载体命名为ULIP,包括UBC启动子和IRES连接,能同时表达荧光素酶基因和Puromycin抗性基因。以ULIP转导人胚胎干细胞H9,并以Puromycin筛选稳定转导的细胞。随后移植于BALB/c小鼠和RAG-/-γC-/-小鼠,在Xenogen IVIS(r)50成像系统进行荧光信号检测。结果稳定转导ULIP或LTBR-GIP的H9移植到BALB/c小鼠,ULIP组3d后荧光信号明显减弱,5d后基本上不能检出。而移植到RAG-/-γC-/-小鼠后,ULIP组的荧光信号在第3天稍有下降,随后荧光信号逐渐增强。LTBR-GIP-H9在移植BALB/c小鼠和RAG-/-γC-/-小鼠后均未能检测到荧光信号。结论荧光素酶报告基因可以用于观察移植细胞在体内的动向,实现实时观察移植细胞的存活情况。
- 蔡柳洪张滨陈世钦曾敏慧陶欣
- 关键词：荧光素酶报告基因慢病毒载体人胚胎干细胞
- 卵巢早衰患者来源的诱导多能干细胞的建系、鉴定及诱导分化被引量：8
- 2016年
- 目的:建立和鉴定卵巢早衰(又称原发性卵巢功能不全,primary ovarian insufficiency,POI)患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs),研究其向原始生殖细胞分化的潜能。方法:将表达Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4和Lin28基因的p EB-C5和表达SV40 T抗原的p EB-Tg质粒转染POI患者的外周血单个核细胞,将其重编程为i PSCs并检测其干细胞多能性特性。添加转化生长因子β1(transfroming growth factor-β1,TGF-β1)和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)后,应用real-time PCR和Western blot方法分别检测原始生殖细胞标志物的mRNA及蛋白表达水平。结果:通过碱性磷酸酶染色、细胞免疫荧光、拟胚体及畸胎瘤形成检测,证明了POI患者外周血来源的i PSCs可成功向3胚层细胞分化并保持多能性。添加TGF-β1和BMP4后,诱导组原始生殖细胞特异性标志物干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor,c-Kit)、发育多能性相关蛋白3(developmental pluripotency-associated 3,STELLA/DPPA3)和DEAD盒多肽4(DEAD box polypeptide 4,VASA/DDX4)的mRNA水平明显升高(P<0.05),VASA/DDX4蛋白表达水平亦明显增加(P<0.05)。结论:POI患者外周血单个核细胞在体外可被成功诱导成无外源性基因整合的i PSCs,并且具有多能分化特性,添加TGF-β1和BMP4后可向原始生殖细胞分化。
- 文艳飞蔡柳洪何文曾敏慧蒋满波
- 关键词：诱导多能干细胞原始生殖细胞
- 地中海贫血患者来源外周血及脐带血细胞诱导式多能干细胞的建系和造血分化被引量：4
- 2015年
- 目的探讨地中海贫血(地贫)患者特异诱导式多能干细胞系(i PSCs)细胞模型的建立及造血分化能力。方法采集Hb H病引产胎儿(α地贫)的脐带血、双重杂合子β地贫输血患者(基因型为IVS-Ⅱ-654/CD17)外周血各1例,分离单核细胞后进行短期培养,核转染再程序化为i PSCs,检测i PSCs未分化状态和多能性标志物。i PSCs与OP9细胞共培养向造血干细胞诱导分化,进行吉姆萨染色检查和流式细胞术检测造血干细胞的分化结果。结果地贫患者i PSCs表达干细胞多能性标志物Oct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81,碱式磷酸酶染色阳性,悬浮培养可以形成类球形拟胚体,畸胎瘤形成实验显示地贫患者i PSCs可分化为内、中、外胚层细胞。流式细胞术检测结果显示CD34+细胞分别为8.71%(α-i PSCs分化结果)和4.46%(β-i PSCs分化结果)。结论α、β地贫患者外周血与脐带血可再程序化为i PSCs,该细胞系具有多能分化特性,与OP9共培养能分化为造血干细胞。
- 曾敏慧蒋满波文艳飞彭澄张滨蔡柳洪
- 关键词：地中海贫血造血分化
- 血管内皮生长因子对大鼠卵巢组织自体移植后的形态与功能的影响被引量：1
- 2012年
- 目的:初步探讨血管内皮生长因子(VEGF)在卵巢组织自体移植中的应用价值。方法:将健康成熟未交配过的20只雌性SD大鼠随机分为2组,A组去势后自体异位移植新鲜卵巢组织,B组去势后自体异位移植经VEGF处理过的新鲜卵巢组织。移植后饲养4周,观察动情周期的恢复情况和卵巢组织的形态学变化,测定血清中的激素水平。结果:B组大鼠的雌二醇水平明显高于A组,其差异有统计学意义(P<0.05);B组移植卵巢组织的体积明显大于A组,其差异有统计学意义(P<0.05);对形态正常的各级卵泡统计分析,生长卵泡数目在各组之间的差异没有统计学意义。结论:在卵巢组织移植过程中使用VEGF,可以减少卵巢组织的缺血再灌注损伤,有助于促进卵巢组织功能的恢复。
- 邢卫杰蔡柳洪李予王文军麦美琪杨冬梓张清学
- 关键词：卵巢血管内皮生长因子
- 男性相关因素对夫精宫腔内人工授精妊娠率的影响被引量：4
- 2013年
- 目的:探讨在宫腔内人工授精(IUI)过程中男性相关因素对妊娠成功率的影响,为临床IUI治疗不育提供参考。方法:选取排除女方因素和双方因素所导致的219周期不育IUI的资料,统计分析其中男性相关因素(如年龄、学历、不育年限以及精子形态正常率、精液处理前后前向运动精子数等)与妊娠率的关系。结果:共行IUI治疗219周期,妊娠23例,周期妊娠率为10.5%。随着男方年龄增长,拥有正常精子形态的人群比例呈下降趋势,差异有统计学意义。40岁以上年龄组妊娠成功率低于其他组(P<0.05),高学历组妊娠成功率也较其他组低,但比较差异无统计学意义(P>0.05)。男方不育年限各分组中妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。精子形态率正常组的妊娠率稍高于异常组,IUI妊娠率随着精液处理前后的前向运动精子数的增加均有上升的趋势,但比较差异无统计学意义。结论:男方年龄对正常精子形态的影响有统计学意义,但是男方学历、不育年限、处理前后的前向精子总数以及精子形态学等对IUI成功率无明显影响。
- 陈世钦蔡柳洪张滨邢卫杰
- 关键词：宫腔内人工授精妊娠率
- 卵巢早衰患者来源特异干细胞分化为单倍体细胞的研究
- 2019年
- 目的探索卵巢早衰患者来源的诱导多能干细胞(POF-iPSC)分化为单倍体细胞的可能。方法以卵巢早衰患者外周血单个核细胞进行核转染自行建系POF-iPSC,培养基中添加激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂CHIR-99021共2 d,随后添加骨形态生成蛋白4及表皮生长因子5 d,再添加视黄酸7 d,设基线(D0)、培养7 d(D7)、培养14 d(D14)组及无诱导的对照组。应用实时定量PCR及免疫荧光染色分别检测原始生殖细胞或减数分裂相关基因的mRNA及蛋白表达水平;荧光原位杂交技术(FISH)检测细胞内X染色体单体;流式细胞仪检测单倍体细胞比例。结果 POF-iPSC在诱导过程中,D0组细胞形态为长梭形纤维样,D7组细胞体积变大,但胞质稀薄,具有多个触角,D14组细胞核及核仁变得明显。在mRNA相对表达水平上,NANOG随分化而下降,BLIMP1逐步上升,STELLA、OCT4、DDX4、γH2AX、MLH1于D7组最高,DAZL、SYCP3、PRDM9于D7组及D14组逐步提高(P均<0.01)。在蛋白表达上,D0组细胞中DAZL、PRDM9、SCP3蛋白均呈阴性表达,D7组细胞中DAZL及PRDM9蛋白呈阳性表达,D14组细胞中DAZL、PRDM9、SCP3蛋白均呈阳性表达。针对X染色体着丝粒的FISH检测显示,对照组细胞中均未见单个X染色体显色的细胞;D14组的部分细胞核中有单个X染色体显色,提示其单倍体的可能。D0组、D7组、D14组及对照组细胞中均可见发生分裂状态的染色体。其中D14组单倍体细胞比例高于D0组、D7组及对照组(P均<0.01)。结论 POF-iPSC体外培养后能分化为类原始生殖细胞,部分细胞可完成减数分裂为单倍体细胞。
- 吕杰韩婵琳何文蔡柳洪
- 关键词：卵巢早衰诱导多能干细胞减数分裂卵子
- 人卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞体外培养方法比较被引量：1
- 2018年
- 目的:建立有效分离、提纯及培养人卵丘颗粒细胞的方法,并与人壁层颗粒细胞的体外培养相比较。方法:收集卵胞浆内单精子显微注射取卵时的卵泡液和直接机械分离卵母细胞所得的卵丘颗粒细胞复合物,直接将卵丘颗粒细胞复合物接种于培养皿中培养。用密度梯度离心法分离卵泡液中的人壁层颗粒细胞。用免疫荧光法检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达;用CCK-8法检测细胞生长曲线;用ELISA检测这2种颗粒细胞分泌雌激素的能力。结果:直接法所得人卵丘颗粒细胞培养24 h后可贴壁,体外培养生长状态与人壁层颗粒细胞相似;免疫荧光检测显示两者均表达FSHR;CCK-8实验结果表明,两者体外培养生长曲线相似;ELISA结果显示两者分泌雌激素能力相当。结论:利用机械切割获得人卵子周围卵丘颗粒细胞复合物直接培养的方法操作简单,获得的人卵丘颗粒细胞具有与人壁层颗粒细胞相似的生长状态、生长曲线以及雌激素分泌能力,可作为人颗粒细胞亚群体外培养方法的补充。
- 何文吕杰李涛文艳飞韩婵林蔡柳洪
- 关键词：细胞分离体外培养卵泡刺激素受体
- 地中海贫血“integration-free”诱导多能干细胞的建立及造血分化的研究被引量：2
- 2015年
- 目的:建立无外源基因整合(integration-free)的地中海贫血患者特异诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC),并研究其向造血前体细胞分化的可能性。方法:用核转染的方法将表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28转录因子的质粒p EB-C5以及表达SV40大T抗原的质粒p EB-Tg导入引产巴氏水肿胎皮肤成纤维细胞中,将其重编程为i PSC后检测其向3个胚层细胞分化的特性。将i PSC细胞与小鼠OP9细胞共培养向造血前体细胞诱导分化,检测造血前体细胞特异性抗原。结果:成功建立了巴氏水肿胎皮肤成纤维细胞来源的α地中海贫血患者特异i PSC系,其具有向3个胚层分化的能力,与OP9细胞共培养9 d后可检测到造血前体细胞标记CD34的阳性率为18.7%,CD34和CD45双阳性为12.2%。结论:巴氏水肿胎皮肤成纤维细胞可成功诱导成"integration-free"i PSC,该细胞系具有向3个胚层分化的能力,与OP9共培养可向造血前体细胞分化。
- 蒋满波曾敏慧章钧文艳飞张滨蔡柳洪
- 关键词：地中海贫血诱导多能干细胞造血分化
