国家科技重大专项(2002AA2Z3344)
- 作品数：9 被引量：38H指数：4
- 相关作者：洪岸何贤辉徐丽慧林剑汪炬更多>>
- 相关机构：暨南大学教育部河北医科大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- bFGF信号传导及其与肿瘤关系的新进展被引量：13
- 2005年
- 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是FGF家族的重要成员,具有促细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种功能,并与肿瘤病理存在一定相关性。bFGF生物学作用的多效性,来源于其信号传导途径的复杂性。本文简要介绍近年来bFGF信号传导中bFGF亚型、HSPG、FGFR和其他调控蛋白等研究的新进展,并浅析其与肿瘤生长、血管生成、肿瘤抑制及抑制分子机制等方面的关系。
- 邱垂源洪岸林剑
- 关键词：肿瘤信号传导
- 重组人bFGF的原核表达及其高效价抗血清的制备被引量：9
- 2005年
- 目的以重组人碱性成纤维生长因子为免疫原,制备高效价抗hbFGF抗血清。方法通过PCR方法改造5’编码区的12个密码子,构建hbFGF原核表达载体并在大肠杆菌(E.coli)中表达,以纯化的hbFGF免疫新西兰兔,制备高效价抗血清,用于重组hbFGF的免疫印迹分析。结果经过改造的hbFGF基因在E.coli中获得较高水平表达。从可溶性部分纯化得到纯度95%以上的重组hbFGF,以该重组蛋白免疫兔子,在二次加强后以间接ELISA检测抗血清效价可达1∶512000。免疫印迹分析显示该抗血清与E.coli中表达的重组hbFGF和标准hbFGF均有特异性反应,但与某些细菌蛋白存在弱交叉反应,经E.coli菌体蛋白吸附的抗血清,与菌体蛋白的弱交叉反应消失。结论以纯化的重组hbFGF为免疫原制备了高效价的特异性抗血清,经菌体蛋白吸附可消除存在的交叉反应性。
- 徐丽慧洪岸何贤辉汪炬
- 关键词：碱性成纤维生长因子可溶性表达抗血清交叉反应性
- 可溶性EGF受体胞外域在HeLa细胞中的表达及鉴定
- 2006年
- 目的:在哺乳动物细胞中表达可溶性人表皮生长因子受体(sEGFR)并进行鉴定。方法:以带信号肽的sEGFR的真核表达载体pEGFR s或pEGFP-N1空载体转染HeLa细胞,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析外源基因的表达水平,并以免疫印迹法分析培养上清中的sEG-FR。结果:转染pEGFP-N1的HeLa细胞,48 h后EGFP的表达百分率可达83%,而转染pEGFR s载体的HeLa细胞EGFP阳性率为4.8%,表明由于插入的sEGFR基因包含终止密码而抑制了EG-FP的表达;共聚焦显微镜观察也得到一致的结果。进一步以抗EGFR结构域L2的抗血清进行免疫印迹分析证明,转染pEGFR s的HeLa细胞培养上清液中表达sEGFR,存在相对分子质量为83 000和80 000两种产物。结论:转染表达载体的HeLa细胞分泌表达sEGFR。
- 徐丽慧洪岸何贤辉
- 关键词：表皮生长因子受体HELA细胞
- 人EGF受体胞外域cDNA克隆及其序列分析被引量：6
- 2005年
- 目的:克隆编码人表皮生长因子受体(EGFR)胞外域的cDNA ,构建可溶性EGFR(sEGFR)的哺乳动物细胞表达载体。方法:以RT -PCR方法从人胎盘中克隆编码EGFR胞外域的cDNA ,测定其序列,构建sEGFR真核表达载体。结果:从人胎盘绒毛组织中成功克隆编码EGFR胞外域的cNDA ,通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并添加终止密码,构建了sEGFR的真核表达载体。该基因编码的蛋白质包含信号肽以及L1、S1、L2和S2等4个结构域。序列分析表明该基因有3个碱基与以往报道的基因不同,即15 6 2G→A、16 2 0G→C、1887T→A ,前两个改变导致氨基酸Arg4 97Lys和Lys5 16Asn的改变,后一个为同义突变Thr6 0 5。结论:成功克隆编码EGFR胞外域的cD NA 。
- 徐丽慧洪岸何贤辉
- 关键词：表皮生长因子受体单核苷酸多态性
- 人EGF受体胞外域在大肠杆菌中表达、复性及抗原性鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的构建人EGF受体(EGFR)胞外域的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备EGFR特异性抗体,对表达产物进行鉴定。方法以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码胞外结构域L1、S1、L2(EGFRLSL)的DNA片段,并在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET3c连接构建EGFRLSL原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达;同时以纯化的EGFRL2结构域蛋白(EGFRL2)制备抗血清,以此抗血清鉴定表达产物。结果EGFRLSL在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,抗His6抗体免疫印迹分析表明,表达产物全部以包涵体形式存在,通过Ni2+NTA柱上复性获得纯化的可溶性EGFRLSL蛋白;免疫印迹分析表明,EGFRLSL与小鼠抗EGFRL2抗血清具有高特异性反应。结论从大肠杆菌中获得具有特异抗原性的可溶性EGFRLSL蛋白。
- 徐丽慧洪岸何贤辉
- 关键词：表皮生长因子受体包涵体抗原性
- 氨基酸定点突变碱性成纤维生长因子的稳定性
- 2006年
- 为了提高碱性成纤维生长因子的体外稳定性,分析比较了野生型人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)和半胱氨酸(Cys)定点突变型hbFGF的生物活性、肝素结合能力、体外聚合程度和聚合成分,以及两种蛋白单体的表面静电分布和溶剂可及表面面积.结果表明,突变型hbFGF保持了野生型hbFGF的生物活性以及肝素结合能力,并显著了降低了体外聚合程度,而单体三维结构中的静电分布和溶剂可及表面面积变化不明显.由此可见,Cys突变影响了hbFGF的共价聚合,而对非共价聚合影响不大.
- 谢秋玲张玲洪岸
- 关键词：碱性成纤维细胞生长因子稳定性定点突变静电作用疏水相互作用
- 重组环状胸腺五肽结构类似物Cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-)的制备、鉴定和活性检测被引量：2
- 2006年
- 为了实现蛋白内含肽(Intein)介导的重组环状胸腺五肽结构类似物[cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-),cTP]的高效制备,设计并合成编码6个氨基酸的cTP基因,克隆到表达载体pTWIN1,重组表达质粒pTW-cTp转化E.coliER2566构建工程菌,IPTG诱导由几丁质结合域纯化标签(chitinbindingdomain,CBD)、2个蛋白内含肽和目的多肽组成的“多元”融合蛋白(CBD-intein1-cTP-intein2-CBD)的高效表达.几丁质柱亲合层析纯化融合蛋白后,改变pH值和温度诱导intein1C端切割,硫醇MESNA诱导intein2N端切割,释放N端为Cys,C端为硫酯的重组cTP线性前体,通过非保护多肽硫酯环合法实现环肽生成.激光飞行质谱结果显示,纯化产物的分子量为764·4,与环肽的理论值相符.免疫活性检测结果显示,环肽cTP较线性多肽TP-5具有更显著的促进巨噬细胞吞噬能力的活性(P<0·01)和促进B细胞抗体生成的活性(P<0·01).
- 余榕捷高媛林剑谢秋玲谭毅力洪岸周天鸿
- 人EGF受体L2结构域在大肠杆菌中表达、包涵体柱上复性及纯化被引量：8
- 2005年
- 以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR_L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET_3c连接构建EGFR_L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni2+_NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR_L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95%,复性的EGFR_L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni2+_NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。
- 徐丽慧洪岸何贤辉
- 关键词：表皮生长因子受体包涵体重折叠
- 重组人碱性成纤维细胞生长因子的柱复性研究被引量：2
- 2005年
- 收集rhbFGF工程菌菌体,包涵体纯化后经凝胶过滤柱复性,所得复性后bFGF通过肝素亲和柱纯化并测活。各种复性方案中复性后bFGF比活最高为2.5×105U/mg,得率最高为74%。复性液中的变性剂浓度及是否含有还原剂,柱流速及柱体积都会影响复性后bFGF的得率和活性。
- 汪炬曹莹洪岸刘侃
- 关键词：重组人碱性成纤维细胞生长因子复性包涵体成纤维细胞因子细胞增殖
