四川省杰出青年科技基金(07ZQ026-132)
- 作品数：7 被引量：15H指数：2
- 相关作者：汪铭书程安春朱德康陈孝跃李传峰更多>>
- 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室更多>>
- 发文基金：四川省杰出青年科技基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”四川省重点科学建设项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立被引量：8
- 2008年
- 【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min后,以10%马血清37℃下封闭30min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈"334"分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。
- 张舍郁程安春汪铭书沈婵娟李传峰
- 关键词：间接免疫荧光抗原定位
- 原位杂交在病原微生物检测中的应用被引量：1
- 2010年
- 原位杂交技术是分子遗传学与细胞遗传学相结合而产生的一门新兴技术,具有很高的敏感性和特异性,在当今细胞生物学、分子生物学研究中有着广泛的应用。文章对原位杂交的产生和发展、基本方法和特点及其在病原微生物检测方面的研究进展进行了阐述。
- 娄昆鹏程安春汪铭书
- 关键词：原位杂交病原微生物
- 不同条件对鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组二维电泳分析结果的影响被引量：1
- 2009年
- 本研究以鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞为材料,围绕影响二维电泳因素进行全面探讨,以建立和优化鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组二维电泳模型。结果表明,样品经过冷丙酮处理,水化液DTT浓度为30 mmol/L都有利于等电聚焦;采用pH5～8 IPG窄胶条和混合两性载体电解质pH3～10/pH5～8为2/1比pH3～10 IPG宽胶条和单一两性载体电解质pH3～10分离蛋白时,各蛋白点间距较大,分辨率高,更有利于显示低丰度蛋白点;1.5 mg的蛋白上样量偏大,2～DE图像出现拖尾和水平条纹,部分相邻高丰度的蛋白重叠,且还掩盖了低丰度蛋白点。PDQuest7.40软件分析显示:17 cmpH5～8 IPG胶条电泳鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组,银染可获得1 253个蛋白点,而考染却检测到388个蛋白点;重复试验仍获得清晰、稳定的2-DE图像,同一样本不同时期,考染可获得约348、331个蛋白点,蛋白点匹配率达88%,表明了鸭瘟病毒感染细胞蛋白质组二维电泳模型稳定、分辨率高、重复性好,为鸭瘟病毒蛋白组的进一步研究和新蛋白的发现提供了重要的研究方法。
- 贾仁勇程安春汪铭书郭宇飞徐超齐雪峰袁桂萍朱德康丁轲龚永强杨梅陈孝跃
- 关键词：蛋白质组二维电泳鸭瘟病毒成纤维细胞
- 鸭肿头出血症病毒强毒的致病性及感染组织细胞的超微病理变化被引量：2
- 2007年
- 将鸭肿头出血症病毒（DSHDV）强毒株以不同途径接种10日龄鸭胚，研究了病毒在鸭胚中的繁殖规律，并用透射电镜观察了感染鸭胚各组织器官的超微结构变化，同时用DSHDV人工感染不同日龄雏鸭，比较了不同感染途径对雏鸭的致病性和对不同日龄雏鸭的致病性。结果显示，尿囊腔和卵黄囊2种途径均能使病毒在鸭胚上繁殖并传代，对鸭胚的半数致死量分别为10^-7.24／0．2mL和10^-6.4／0．2mL。病毒感染鸭胚后，电镜下可观察到肝和尿囊膜中的病毒粒子，病毒粒子呈球形或椭圆形，大小为60～80nm，无囊膜；病毒在细胞浆内复制，可形成特征性包涵体；病毒侵害的主要靶器官为尿囊膜与肝，细胞器的变化主要表现为粗面内质网扩张以及线粒体肿胀和嵴断裂、消失。病毒经肌肉注射、口服和滴鼻均能使28日龄鸭感染发病，致死率分别为86％、89％和97％。研究表明，DSHDV能很好地在鸭胚上生长并致鸭胚各组织器官超微结构发生变化，不同感染途径均能使雏鸭感染发病且致病性强。
- 张舍郁朱德康程安春汪铭书沈婵娟李传峰张娜
- 关键词：鸭胚雏鸭
- 鸭瘟病毒UL24基因的分子特征分析被引量：1
- 2009年
- 根据本实验室获得的鸭瘟病毒的一段基因序列设计引物，利用PCR扩增UL24基因并克隆到pMD18-T载体，阳性重组质粒进行酶切鉴定、测序验证与生物信息学分析。结果显示，获得的UL24基因全长1230bp，编码409个氨基酸；与其他26株疱疹病毒科中α-疱疹病毒亚科的UL24基因的相似性较β和γ亚科高，其中与α亚科禽疱疹病毒属中的GaHV-3相似性最大（34．7％）；遗传进化树显示，该基因编码的蛋白与火鸡疱疹病毒的UL24蛋白的亲缘性最近。该蛋白是一种保守但不含信号肽的外膜蛋白，具有5个潜在的N-糖基化位点和19个磷酸化位点；编码的氨基酸Ala，Apn，Glu，Phe，Leu，Arg，Thr，Val具有一定的偏嗜性。二级结构分析显示，α螺旋和无规卷曲含量高，均达46．94％，而口折叠仅占6．11％；同源建模比对，未发现与之匹配的三级结构；预测的抗原表位主要位于肽链第36～48、241～323、344～379位区段。
- 贾仁勇程安春汪铭书葛菡朱德康信洪一齐雪峰陈孝跃
- 关键词：鸭瘟病毒分子特征生物信息学分析
- 免疫组化技术在病原微生物检测中的应用被引量：2
- 2008年
- 蒲阳程安春汪铭书
- 关键词：免疫组化技术微生物检测免疫组织化学技术抗体反应肺炎双球菌荧光素标记
- 鸭呼肠孤病毒强毒株致鸭胚原代成纤维细胞凋亡的研究被引量：2
- 2008年
- 通过光镜、电镜、DNA Ladder法、流式细胞术、荧光染色对鸭呼肠孤病毒（DRV）诱导鸭胚原代成纤维细胞（DEF）凋亡情况进行检测。结果显示，光镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩，染色质浓染边移；电镜观察到细胞胞浆浓缩，细胞核染色质凝聚、部分形成凋亡小体；荧光染色结果显示，在感染后24h有激发绿色荧光的凋亡细胞出现，随着时间的推移，激发红色荧光的死亡细胞数量增多；DNA Ladder检测到感染后24～144h的DNA样品呈梯形条带；流式细胞术于感染后24h检测到凋亡细胞，其数量在72～96h达到高峰，144h开始下降。研究结果表明，DRV在DEF增殖的过程中具有诱导宿主细胞凋亡的作用。
- 张娜程安春汪铭书李传锋陈孝跃
- 关键词：细胞凋亡
