国家自然科学基金(31070819)
- 作品数：9 被引量：12H指数：2
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- 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白可增强DnaJ蛋白的免疫反应被引量：2
- 2014年
- 目的:明确鞭毛蛋白的黏膜佐剂作用,并研究其与DnaJ蛋白联合免疫对肺炎链球菌感染的保护作用。方法:含有重组质粒pET-28(a)/鞭毛蛋白基因的大肠杆菌DE3经IPTG诱导后表达鞭毛蛋白,纯化后用于后期动物实验如下:将C57BL/6小鼠随机分为四组通过鼻腔分别滴入鞭毛蛋白(10μg)与DnaJ蛋白(10μg)混合剂(实验组)、DnaJ蛋白(10μg)(对照组1)、DnaJ蛋白(10μg)与GST蛋白(10μg)混合剂(对照组2),每组均30μl。通过检测抗体的效价、亚型以及细胞因子水平来评估鞭毛蛋白能否提高肺炎链球菌DnaJ蛋白诱导的免疫效应;然后用肺炎链球菌D39(5×107CFU)进行鼻腔攻毒,观察小鼠的生存率,以评估其保护效应。结果:实验组较对照组产生更高效价的血清IgG(其中主要产生IgG1)和更高水平的细胞因子IFN-γ、IL-17A和IL-4;另一方面实验组对致死性D39感染的保护率达60%,DnaJ蛋白免疫组的保护率为50%。结论:鞭毛蛋白与DnaJ蛋白联合应用可以增强宿主对DnaJ蛋白的免疫反应,并且对致死剂量的肺炎链球菌感染有保护作用,提示鞭毛蛋白可以作为肺炎链球菌DnaJ蛋白疫苗的佐剂应用。
- 严明刘宇思张帅胥文春王虹张雪梅
- 关键词：鞭毛蛋白肺炎链球菌佐剂
- 热灭活肺炎链球菌D39X疫苗黏膜免疫小鼠可抵抗不同亚型肺炎链球菌感染被引量：2
- 2013年
- 目的研制一种安全、有效且易于生产的热灭活肺炎链球菌死菌疫苗D39X,评价其作为肺炎链球菌候选疫苗的可行性。方法通过热灭活肺炎链球菌突变菌株D39X,得到无毒的死菌疫苗,鼻腔免疫Balb/c小鼠,每周1次,连续4周。末次免疫1周后,间接ELISA检测免疫小鼠特异性抗体水平;同时检测抗体亚型及细胞因子水平,并进行不同菌株攻毒的主动保护实验。结果免疫组小鼠血清中特异性IgG和唾液中特异性IgA显著升高,IgG亚型主要为IgG1和IgG2b;免疫小鼠脾细胞特异性分泌IL-4和IL-17A;19F型肺炎链球菌在免疫小鼠中的载量显著低于对照组小鼠;灭活D39X黏膜免疫可有效延长肺炎链球菌D39、6B型和3型感染小鼠的生存时间;被动免疫也具有保护作用。结论热灭活的D39X黏膜免疫可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应,有效抵抗不同血清型肺炎链球菌的感染,是一种有开发前景的肺炎链球菌疫苗。
- 徐绣宇王一平蔡莺莺刘宇思王虹胥文春何於娟尹一兵张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌黏膜免疫
- 肺炎链球菌热休克蛋白ClpL的原核表达、纯化及抗原特性分析
- 2012年
- 目的原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)热休克蛋白ClpL,并评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性。方法PCR扩增S.pn D39全长ClpL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组ClpL蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗ClpL多克隆抗体的效价及亚型;Western blot分析ClpL蛋白在5种常见S.pn中的保守性;流式细胞术及Western blot分析ClpL蛋白在S.pn中的亚细胞定位。结果重组表达质粒pET-28a(+)-ClpL经双酶切及测序证实构建正确;ClpL蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度达90%,浓度为4.97 mg/ml;免疫小鼠可产生高滴度、高特异性的IgG抗体,以IgG1和IgG2b亚型为主;ClpL蛋白在5株常见S.pn中均有表达;ClpL蛋白为分泌型蛋白,不表达于S.pn表面。结论原核表达并纯化了S.pn ClpL蛋白,其作为一种在S.pn中保守存在的分泌型蛋白,可能是一种较好的疫苗候选蛋白。
- 钟文张群龚艺张彦青陈倩陈特董杰王虹张雪梅
- 关键词：链球菌肺炎原核细胞纯化
- 肺炎链球菌蛋白PotD的表达纯化及免疫活性分析被引量：1
- 2014年
- 目的研究PotD蛋白免疫保护活性,探讨其作为疫苗候选蛋白的可能性。方法构建、表达、纯化PotD蛋白,通过免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,评估其免疫原性,并进一步分析其对儿童的免疫保护效应;采用PCR技术扩增8株不同血清型S.pn中PotD基因后进行测序鉴定分析基因序列的保守性;再通过western blot技术分析8株菌中PotD蛋白的表达水平,以评估PotD蛋白保守性;采用粘附抑制实验分析PotD蛋白的免疫保护活性。结果成功获得纯度大于95%的PotD目的蛋白,将其免疫小鼠后获得高效价抗体;在10岁以下儿童S.pn感染者及健康带菌者血清中均有抗PotD存在;对8株不同血清型S.pn PotD基因进行PCR扩增和测序发现8株细菌中该基因具有高度保守性;Western blot技术分析证实,8株不同血清型S.pn均表达该蛋白;粘附抑制实验证实,重组PotD蛋白及其抗体均能够显著抑制S.pn对A549细胞的粘附作用。结论 PotD蛋白制备方便,在我国流行S.pn血清型中有良好的保守性和免疫原性,能够显著抑制S.pn对宿主细胞的粘附,可能成为良好的蛋白疫苗靶点。
- 闵迅黄健黄美容钟文董杰陈特张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌保守性抗原性
- 肺炎链球菌溶血素ΔA146Ply黏膜免疫的保护效果被引量：3
- 2011年
- 目的探讨肺炎链球菌146位氨基酸缺失的溶血素ΔA146Ply蛋白的保护作用,评价其作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的可行性。方法将BALB/c小鼠分为2组:试验组(15μgΔA146Ply蛋白与1 mg/ml CT佐剂的混合物30μl)和对照组(PBS与CT佐剂的混合物30μl),经鼻腔免疫小鼠,每周1次,连续4周。末次免疫1周后,ELISA检测免疫小鼠血清及唾液中特异性抗体水平;并进行ΔA146Ply对多种血清型肺炎链球菌感染的主动保护试验及其特异性抗血清的被动保护试验;West-ern blot分析Ply蛋白在肺炎链球菌中的保守性;间接ELISA检测免疫小鼠血清IgG抗体亚型和细胞因子IL-17A水平。结果试验组小鼠血清中IgG效价为5.12×105,唾液中IgG及IgA效价分别为4.0×103和4.8×103;ΔA146Ply黏膜免疫可有效延长小鼠的生存时间,并提高其生存率;其对肺炎链球菌NCTC7466、CMCC(B)31436、CMCC(B)31614和CMCC(B)31207的保护率分别为50.0%、41.7%、50.0%和41.7%;被动免疫保护试验试验组小鼠的存活率为70%;ΔA146Ply黏膜免疫诱导的抗体亚型主要为IgG1和IgG2b,IL-17A的水平高达(678.55±189)pg/ml,于刺激后48 h达峰值。Ply在4种菌株中均具有良好的保守性。结论ΔA146Ply黏膜免疫可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应,能有效抵抗多株致病性肺炎链球菌的感染,提示ΔA146Ply是肺炎链球菌较好的疫苗候选蛋白。
- 姚润崔亚利袁军王虹龚艺尹一兵张雪梅
- 关键词：小鼠
- 肺炎链球菌神经氨酸酶nanA蛋白的原核表达、纯化及其免疫保护效果被引量：3
- 2015年
- 目的原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)神经氨酸酶nan A蛋白,并在小鼠模型中检测其保护效果,评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性。方法构建重组原核表达质粒p ET28a(+)-nan A,重组nan A蛋白经IPTG诱导及Ni-NTA亲和层析柱纯化后,采用黏膜(与CT佐剂混合)和腹腔(与Alum佐剂混合)给药途径免疫BALB/c小鼠,建立相应的S.pn感染模型,同时设相应对照组(佐剂+PBS),ELISA法检测特异性抗体及亚型;小鼠鼻腔滴定试验检测主动免疫保护效果;体内抗定植试验检测nan A蛋白对19F型S.pn在鼻咽部定植的保护作用。结果重组表达质粒p ET28a(+)-nan A经双酶切(NdeⅠ/XhoⅠ)及测序鉴定证明构建正确;重组蛋白的相对分子质量为55 000,主要以可溶性形式表达,约占菌体总蛋白的55%,纯化后纯度达90%;黏膜免疫组小鼠唾液中Ig A及Ig G效价分别为1.6×103和3.2×102,血清中Ig G效价为2.0×106,亚型主要为Ig G2a;腹腔免疫组血清中Ig G效价为0.5×106,亚型主要为Ig G1;黏膜和腹腔免疫小鼠生存时间较相应对照组显著延长(P<0.05),黏膜免疫组小鼠生存率较其对照组显著增加;黏膜免疫可显著降低S.pn 19F在宿主鼻咽部和肺部的定植。结论原核表达并纯化了nan A蛋白,诱导的小鼠免疫反应可有效抵抗S.pn的感染,并可显著降低S.pn在宿主鼻咽部及肺部的定植,表明nan A蛋白是较理想的S.pn疫苗候选蛋白。
- 黎美君曹炬闵讯蔡莺莺尹一兵张雪梅王虹
- 关键词：肺炎链球菌纯化
- 转化缺陷的R6菌株经黏膜免疫小鼠可抵抗肺炎链球菌有毒株感染
- 2013年
- 目的研制一种无转化能力的肺炎链球菌(S.pn)减毒株R6ΔcomE,评价其作为S.pn活菌疫苗的保护效果。方法构建comE基因缺陷的R6ΔcomE株,评价R6、R6ΔcomE株的转化能力及其毒力;用R6、R6ΔcomE株分别对BALB/c小鼠进行黏膜免疫,用ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体效价和脾细胞上清中IFN-γ、IL-4及IL-17A水平;用D39株经鼻腔黏膜感染免疫小鼠,观察生存时间和生存率。结果成功构建comE缺陷的R6ΔcomE株。体外转化实验中R6株转化菌量中位数为1 970 CFU/mL,体内转化实验中每只小鼠34 CFU,体内外实验中R6ΔcomE株转化菌量均为0;感染1×108CFU D39株的小鼠于3 d内全部死亡,而感染相同剂量R6、R6ΔcomE株的小鼠均存活>21 d,且均于感染后72 h内清除细菌。R6、R6ΔcomE株黏膜免疫小鼠后,血清抗体滴度的中位数(P25,P75)分别达1.0×106(6.4×105,1.8×106)、1.2×106(8.1×105,1.6×106),与相应阴性对照组比较差异有统计学意义(P均<0.01);与相应阴性对照组比较,R6、R6ΔcomE株免疫组IL-4、IL-17A均升高(P均<0.01),而IFN-γ水平差异无统计学意义(P>0.05)。黏膜免疫R6、R6ΔcomE株的BALB/c小鼠可抵抗D39株感染,生存率分别为60%和70%。结论 R6ΔcomE株毒力弱,无转化能力,可诱导对S.pn感染的免疫保护,是一株安全有潜力的S.pn减毒活菌疫苗。
- 徐绣宇王一平蔡莺莺刘宇思王虹胥文春何於娟张雪梅尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌黏膜免疫疫苗
- 肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达及免疫活性分析被引量：1
- 2014年
- 目的评价磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(phosphotrans-ferase system,PTS)SPD0295蛋白作为候选疫苗的免疫活性,分析其在不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)中的表达情况。方法以S.pn中D39血清型基因组DNA为模板扩增spd0295基因序列,IPTG诱导表达含6×His标签的SPD0295重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后获得高纯度的目的蛋白;序列比对分析不同血清型S.pn的spd0295基因保守性;SPD0295蛋白与Alum佐剂混合经腹腔注射免疫Balb/c小鼠制备多抗,ELISA法检测其抗体效价,Western blot技术分析抗体的特异性,同时分析该蛋白在7株常见肺炎链球菌中的表达水平。结果spd0295基因在7株不同血清型S.pn中与D39菌株基因序列一致性大于99%;重组蛋白SPD0295免疫小鼠后获得高滴度、高特异性的多克隆抗体;Western blot技术验证了SPD0295蛋白在7株常见肺炎链球菌株中均有表达;黏附抑制试验表明SPD0295蛋白及其抗血清均可抑制细菌的黏附效应。结论 SPD0295蛋白免疫Balb/c小鼠可获得的多克隆抗体具有良好的免疫活性,且在不同血清型S.pn菌株中均有表达,保守性强,是1个潜在的S.pn候选疫苗蛋白。
- 闵迅黄健黄美容黎美君徐绣宇钟文张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌保守性
- 热灭活疫苗HID39免疫小鼠可抵抗肺炎链球菌感染
- 2011年
- 目的研制一种安全、有效且易于生产的肺炎链球菌疫苗,探讨其在BALB/c小鼠中的有效性。方法通过热灭活肺炎链球菌标准菌株D39,得到无毒的、失去感染致病的能力的HID39,用HID39作为疫苗对随机分为阴性对照组(NC)、皮下免疫组(SC)和鼻内免疫组(IN)的小鼠进行免疫,ELISA法检测各组小鼠血清和唾液中的抗体及抗体亚型,并用不同菌株攻毒来评价HID39疫苗的效果。结果 HID39免疫小鼠后,SC组血清中IgG效价高达(12 800±8744),IN组的效价为(4032±1652),而SC组唾液中未检测到IgA,IN组却有(400±197)。抗体亚型以IgG1,IgG2a,IgG2b为主,未检测到IgG3。TIGR4在小鼠鼻内、肺和脑的定植显著下降,其中鼻内免疫的定植量最少。HID39鼻内免疫和皮下免疫都可显著提高致死剂量肺炎链球菌D39、血清型3和6B型感染小鼠的生存率,其中鼻内免疫的小鼠生存率均可达50%,抗血清的被动保护的生存率在50%以上。结论 HID39是一种较成功的肺炎链球菌疫苗,用它免疫小鼠可抵抗肺炎链球菌的感染。
- 姚润姜学美闫文娟王虹张雪梅
- 关键词：肺炎链球菌疫苗小鼠
