国家自然科学基金(81172162)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 相关作者：谭晓华张璇张玉萍靳志平郭智更多>>
- 相关机构：北京军区总医院安徽医科大学山西医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 构建能转染人骨髓间充质干细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体
- 2013年
- 背景:如何将树突状细胞和T细胞活化因子运送至肿瘤局部是有待解决的难题之一。利用人骨髓间充质干细胞具有肿瘤趋向性和低免疫原性的特性,将树突状细胞和T细胞活化因子导入骨髓间充质干细胞后运送至肿瘤局部表达可能是解决上述难题的方案之一。目的:构建共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的5型腺病毒载体(Ad5GM-CSF-IL-2),感染人骨髓间充质干细胞,检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的表达水平和持续时间,为体内活化树突状细胞和T细胞提供实验依据。方法:提取人外周血单个核细胞总RNA,以此为模板用RT-PCR方法扩增粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2基因cDNA,PCR扩增片段分别插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表达载体中,再利用脑心肌炎病毒内部核酸进入位点(IRES)序列,构建腺病毒载体穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2。采用AdMaxTMFLP重组腺病毒载体体系,将穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2与pBGHfrt△E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad5GM-CSF-IL-2。Ad5GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后经γ射线照射使其失去增殖能力,分别用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2ELISA试剂盒在不同的时间点检测细胞上清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2蛋白的水平。结果与结论:经测序证实,克隆获得的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素2的cDNA序列分别与GenBank NM_000758(435bp)和GenBank NM_000586(462bp)提供的序列完全一致。用AdMaxTMFLP重组腺病毒载体可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2两个基因,均获得高效表达。Ad5GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后可连续7d高水平地分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2。
- 张玉萍张璇郭智谭晓华
- 关键词：干细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子骨髓间充质干细胞腺病毒载体
- 多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位被引量：2
- 2012年
- 目的构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的开放读码框,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)Myc/His(B)相应的多克隆位点中,然后将带有膜定位的红色荧光蛋白(ERFP)、核定位的绿色荧光蛋白(EGFP)和胞浆定位的黄色荧光蛋白(EYFP)顺序插入2A肽之间的位点中,构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞,利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果转染24 h后用流式细胞仪检测,可同时检测到EGFP和ERFP的表达,且两种荧光蛋白的表达率十分接近;荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光;共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示3种荧光,ERFP定位在细胞膜上,EGFP在细胞核中,而EYFP在细胞质中。结论通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外,在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器,实现同一细胞中不同的亚细胞定位。
- 靳志平谭晓华
- 关键词：真核表达载体基因表达信号肽序列亚细胞定位
- 共表达CD40L和IL-2的腺病毒对树突状细胞成熟和IL-12产生的影响被引量：1
- 2013年
- 目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L和IL-2,构建Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒载体。分离和培养人Mo-DC后,应用流式细胞仪分析嵌合型腺病毒载体对Mo-DC的感染效率、CD40L基因表达及感染前后Mo-DC表型的变化;采用ELISA法测定Mo-DC培养上清中细胞因子IL-2和IL-12的含量。结果成功克隆CD40L和IL-2基因并构建成5/F35嵌合型腺病毒载体。Ad5/F35嵌合型腺病毒载体能高效感染Mo-DC,感染效率可达75%以上,Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC能有效地表达CD40L和分泌IL-2。感染前Mo-DC中CD80、CD86、CD40和HLA-DR呈一定水平表达,而CD83表达水平较低,感染24 h后,CD80、CD86、CD40和HLA-DR表达水平明显上调,特别是CD83。感染不同时间点测定Mo-DC上清IL-12水平,上清中IL-12水平升高呈时间依赖性。结论 Ad5/F35 CD40L-IL-2能高效感染人Mo-DC并表达相应的基因产物,促进Mo-DC成熟和刺激IL-12的分泌。
- 张璇张玉萍谭晓华
- 关键词：白细胞介素-12
