广东省自然科学基金(06022696)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 可调控表达人骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体系统的构建被引量：1
- 2009年
- 目的构建可调控人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因表达的重组腺病毒载体系统,为骨缺损的修复提供新思路。方法基因测序验证pcDNA3.1-hBMP2质粒的准确性,将酶切得到的hBMP2基因片段亚克隆到穿梭载体质粒pTRE-Shuttle2的多克隆位点,将pTRE-Shuttle2-hBMP2线性化并连接至腺病毒骨架质粒Adeno-XSystem1Viral DNA上,构建重组的Adeno-X-pTRE-hBMP2载体;用PacⅠ酶将其线性化后脂质体法(Lipofectamine2000)转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,收集病毒上清进行hBMP2基因PCR鉴定;将包含rtTA激活因子的Adeno-X Tet-On virus Stock感染HEK293细胞包装扩增病毒。结果hBMP2基因被成功定向克隆到腺病毒骨架质粒Adeno-X System1Viral DNA上,转染HEK293细胞后获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。结论本研究成功构建了hBMP2基因的腺病毒Tet-On表达系统,为实现hBMP2基因在靶细胞水平上的调控表达提供前期实验基础。
- 钱东阳白波严广斌刘琦吴梅祥吴景明谭小波
- 关键词：骨形态发生蛋白腺病毒基因
- 海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊对骨髓间充质干细胞生长分化性状的影响被引量：1
- 2010年
- 目的探讨运用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊化免疫隔离技术对骨髓间充质干细胞(MSCs)生长分化的影响。方法采用脉冲式高压静电微囊制备仪制备出APA-MSCs微囊复合体,在成囊后第1天和第4天运用荧光素双醋酸酯/溴化乙锭(FDA/EB)染色确定MSCs成活率。采用离心破囊方法破囊,培养并观察破囊后MSCs形态和成骨作用等。结果微囊化后细胞在其内存活率约70%～80%;破囊后的细胞有活跃的增殖能力,经茜素红染色证实具有成骨潜力。结论MSCs在APA微囊内生长良好,保持干细胞特有生长分化,APA微囊可用于对MSCs进行免疫隔离。
- 谭小波白波钱东阳
- 关键词：骨髓间充质干细胞细胞分化
- Tet-On系统调控的人骨形态发生蛋白2基因的表达被引量：2
- 2009年
- 目的在骨髓间充质干细胞（BMSC）水平上构建调控表达人骨形态发生蛋白2（hBMP-2）基因的Tet-On系统，在低剂量强力霉素（DOX）诱导下测定其表达水平。方法将hBMP-2的cDNA亚克隆至穿梭载体pTRE—Shuttle2，再定向克隆到腺病毒，构建重组的Adeno-X-hBMP-2载体后，将线性化后的Adeno-X—hBMP-2与携带Tet-On转录活化因子的腺病毒载体BDAdeno—XTet—OnvirusStock分别转染人胚肾293（HEK293）细胞扩增，再共转染小鼠BMSC。在DOX诱导下用RT-PCR检测hBMP-2mRNA的表达，并用ELISA检测DOX诱导浓度与hBMP-2蛋白表达量之间的关系。结果在BMSC水平上成功构建能诱导表达hBMP-2的Tet—On调控系统，RT-PCR可以检测到hBMP-2mRNA显著表达；ELISA检测到浓度为0．01mg／L的DOX，hBMP-2含量为（165．677±0．008）ng／L；高于该浓度时，hBMP-2分泌量对DOX有浓度依赖性（R^2=0．8924，P〈0．05）。结论表达hBMP-2的Tet-On调控系统在低剂量DOX诱导后能够显著表达hBMP-2，并在DOX〉0．01mg／L时有浓度依赖性。
- 钱东阳白波刘琦严广斌吴梅祥吴景明
- 关键词：骨形态发生蛋白质类转染间质干细胞TET-ON骨缺损
- 骨形态发生蛋白-2／骨髓基质干细胞微囊复合磷酸钙骨水泥的蛋白表达
- 2012年
- 目的探讨携带骨形态发生蛋白-2（BMP-2）／Tet-on基因的骨髓基质干细胞（BMSCs）微囊与磷酸钙骨水泥（CPC）多孔支架复合后分泌BMP-2及胶原蛋白的能力。方法以携带BMP－2／Tet-on基因的腺病毒转染大鼠BMSCs，应用微胶囊技术包裹BMSCs。采用食盐造孔法使CPC形成多孔支架。实验分为3组（每组4个样本）：实验组在CPC多孔支架上复合BMSCs-海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊复合体，阳性对照组直接培养含BMP-2／Tet-on基因的BMSCs，单纯A-PA-CPC组在CPC支架上接种空壳微胶囊。培养第3、6、9、12天取3组培养基用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定BMP-2的浓度。实验组固定后做硬组织切片染色观察胶原蛋白的分泌情况。结果培养第3、6、9、12天，实验组BMP-2浓度平均分别为（4713．98±178．50）、（3288．85±194．38）、（1292．25±300．11）、（337．19±84．49）μg／mL，阳性对照组BMP-2浓度平均分别为（4663．87±242．99）、（3250．67±293．72）、（1276．74±157．10）、（293．65±92．48）μg／mL，单纯APA-CPC组BMP-2浓度平均分别为（105．14±10．93）、（91．42±18．00）、（89．63±12．99）、（108．72±23．90）μg／mL，同一时间点3组间比较差异有统计学意义（P〈0．05），其中实验组、阳性对照组分别与单纯APA．CPC组比较差异均有统计学意义（P〈0．05），而实验组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组硬组织切片染色后可观察到淡黄色类骨质、绿色胶原纤维。结论微囊化BMSCs在CPC中可以存活并预期表达BMP-2和胶原蛋白，可以进行下一步体内实验。
- 柳淇元白波谭小波
- 关键词：骨形态发生蛋白质类间质干细胞磷酸钙类
