广东省重大科技专项(2004A30801004)
- 作品数：12 被引量：42H指数：5
- 相关作者：胡旭初余新炳徐劲胡凤玉周红娟更多>>
- 相关机构：中山大学广州医学院杭州市红十字会医院更多>>
- 发文基金：广东省重大科技专项国家高技术研究发展计划广州市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 华支睾吸虫溶血磷脂酶在虫体组织定位及其特异性抗体类型分析
- 2008年
- 目的观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CsLysoPLA)在成虫的组织定位,分析其诱导人体产生的特异性抗体类型。方法应用免疫荧光方法,观察CsLysoPLA在成虫的组织定位;应用ELISA方法,CsLysoPLA重组蛋白检测25份华支睾吸虫病人血清的IgG1、IgG2、IgG4、IgE。结果CsLysoPLA定位于虫体的口吸盘、排泄囊、肠支、生殖孔,与虫体分泌/排泄抗原物质密切相关的部位;以CsLysoPLA重组蛋白检测华支睾吸虫感染者血清,IgG1抗体水平较高,IgG2抗体水平稍高,而感染者的IgG4、IgE水平则与健康人无明显差异。结论CsLysoPLA主要经虫体消化道、生殖道、排泄系统分泌/排泄到体外,刺激人体免疫系统产生Th2为主的免疫应答。
- 马长玲胡旭初胡凤玉郑小凌徐劲吕芳丽余新炳
- 关键词：华支睾吸虫溶血磷脂酶
- 华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析被引量：3
- 2008年
- 目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
- 赵俊红胡旭初徐劲胡凤玉周红娟胡慧霞郑小凌李艳文余新炳
- 关键词：华支睾吸虫组织蛋白酶D天冬氨酸蛋白酶免疫原性
- 华支睾吸虫CsSCCRO基因的表达和鉴定被引量：1
- 2007年
- 目的将目的基因CsSCCRO转染Hela细胞,检测转染效率和表达水平,为进一步在细胞学水平研究编码蛋白的功能提供依据。方法将目的基因CsSCCRO克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,通过脂质体方法转入Hela细胞,RT-PCR和荧光观察来鉴定转录和表达水平。结果真核重组质粒pEGFP-N1-CsSCCRO转入Hela细胞后稳定表达荧光蛋白;RT-PCR鉴定转染的Hela细胞,扩增产物约为780 bp,与预期值相符。结论CsSCCRO基因能够转染到Hela细胞中,并且能与GFP高效转录和翻译成融合蛋白。
- 赵玉利胡旭初马长玲徐劲胡凤玉余新炳
- 关键词：华支睾吸虫
- 华支睾吸虫ATP合酶b亚基的组织和亚细胞定位被引量：2
- 2009年
- 目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)的虫体组织定位,并以HeLa细胞为替代模型观察其亚细胞定位。方法用CsATP-synt_B重组蛋白免疫SD大鼠,取其抗血清对华支睾吸虫成虫石蜡切片进行间接免疫荧光染色,观察CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫组织中的分布。根据生物信息学预测的CsATP-synt_B线粒体转运序列(MTS序列)和核定位序列(NLS序列)位置,设计4组引物[CsATP-synt_B全长序列,以及3个缺失突变体(MTS-缺失线粒体转运序列、NLS-缺失核定位序列、MTS-NLS-线粒体-核定位双缺失)引物],扩增出全长基因和3个突变体基因,构建重组质粒pEGFP-N1-CsATP-synt_B1-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B30-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B(1-238)+(257-300)及pEGFP-N1-CsATP-synt_B(30-238)+(257-300)。将这些重组质粒用阳离子脂质体转染HeLa细胞,48h后用激光共聚焦显微镜观察CsATP-synt_B全长基因和3个突变体在HeLa细胞的表达和亚细胞定位。结果CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫中分布较为广泛,主要分布在腹吸盘、卵巢、卵黄腺和皮层。绿色荧光蛋白GFP表明CsATP-synt_B全长序列表达于线粒体或细胞核,线粒体转运序列缺失突变体表达于细胞核,核定位序列缺失突变体表达于线粒体,双缺失突变体仅表达于胞浆。结论CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫的分布与线粒体的分布一致,主要集中在能量代谢较旺盛的组织部位。CsATP-synt_B蛋白既可进入线粒体,也可进入细胞核,理论预测的定位序列得到证实。
- 胡旭初周红娟胡凤玉马长玲赵俊红黄灿郑小凌徐劲余新炳
- 关键词：华支睾吸虫免疫组织化学亚细胞定位
- 华支睾吸虫溶血磷脂酶对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的作用被引量：9
- 2008年
- 目的:观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CslysoPLA)重组蛋白体外对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的作用。方法:应用免疫荧光方法,观察CslysoPLA重组蛋白是否可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合;应用MTT方法,测定CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的促增殖作用;应用流式细胞术(FCM)检测CslysoPLA重组蛋白对大鼠卵圆细胞细胞周期的影响。结果:CslysoPLA重组蛋白可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合,MTT方法测定结果表明低浓度重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞有一定促增殖作用(P<0.05),20mg/L重组蛋白可促进大鼠卵圆细胞进入G2期,但高浓度重组蛋白可导致大鼠肝星状细胞和卵圆细胞死亡。结论:低浓度的CslysoPLA重组蛋白在体外可刺激大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖,表明CslysoPLA可能是华支睾吸虫导致胆管上皮增生、腺瘤样病变和肝纤维化的效应分子之一。而高浓度的CslysoPLA重组蛋白可引起肝星状细胞和卵圆细胞死亡,表明CslysoPLA亦可能是华支睾吸虫引起的化学损伤的毒力因子之一。
- 马长玲胡旭初胡凤玉周红娟薛玲余新炳
- 关键词：华支睾吸虫溶血磷脂酶肝星状细胞卵圆细胞
- 华支睾吸虫成虫CsRPEF基因的生物信息学分析被引量：1
- 2009年
- 目的筛选华支睾吸虫的功能基因并进行相应的生物信息学分析。方法使用PCGENE软件、Antheprot-5软件、ExPASy在线分析工具、NCBI上的Blastx程序进行华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(CsRPEF)基因的生物信息学分析。结果获得了CsRPEF基因的序列特征,推测到了CsRPEF的同源蛋白并预测出CsRPEF编码蛋白的分子量、等电点、柔曲性、疏水性、功能性位点等二级结构特征。结论华支睾吸虫成虫CsRPEF基因是一新筛选的功能基因,CsRPEF蛋白是可能参与华支睾吸虫基因转录途径的重要因子。CsRPEF基因的生物信息学分析可为其进一步进行生物学功能的实验研究奠定基础。
- 范为詹苗张咏莉
- 关键词：华支睾吸虫生物信息学分析
- 华支睾吸虫多药物／代谢产物外排蛋白样基因的识别和生物信息学分析被引量：5
- 2008年
- 目的预测华支睾吸虫假想的多药物/代谢产物外排蛋白的结构及功能及其应用前景。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出多药物/代谢产物外排蛋白样基因,分析蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征,根据结构与功能预测其应用前景。结果该基因编码189个氨基酸;含有5段跨膜区,N端在胞内,C端在胞外,具有主要协助因子超家族的结构特征。与日本血吸虫同源蛋白(一致性为67%,相似性为80%)相比,该蛋白的4段跨膜区中含有保守的精氨酸和组氨酸残基。该蛋白含有多个磷酸化位点和T、B细胞表位,且线性B细胞表位均位于胞外区。结论所克隆的华支睾吸虫基因可能编码一个小蛋白型阴离子多药物/代谢物外排蛋白;该蛋白可能定位于华支睾吸虫皮层表膜,是一个潜在的诊断和疫苗候选抗原和药物靶标分子。
- 胡旭初赵宇黄灿刘玲余新炳徐劲
- 关键词：华支睾吸虫疫苗
- 华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)基因的识别及其结构与功能分析被引量：9
- 2007年
- 目的分析华支睾吸虫乳酸脱氢酶基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法利用多种生物信息在线分析工具和分析软件包,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库的表达序列标签(EST)中识别乳酸脱氢酶(CsLDH)基因,预测该基因编码蛋白质的理化特性、氨基酸修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维结构及酶学特性和免疫学特性等。结果该基因全长1224bp,编码区为79～1062,编码328aa,理论分子量为35633Mr,等电点为8.13,半衰期长,理化性质稳定,含有多个潜在的磷酸化和酯酰化位点。预测该蛋白有3个跨膜区,其拓扑结构为N端在膜内侧、C端在膜外侧。有两个主要的线性抗原表位aa10～aa20和aa94～aa102,后者位于膜外,与日本血吸虫LDH相应表位完全一致,与人和小鼠LDH相应表位仅有1个氨基酸差异。该表位中Arg102是酶催化中心的关键氨基酸之一,模拟三维结构显示组成催化中心的另外两个关键氨基酸残基Asp162和His189的空间位置也靠近该表位,酶的催化中心贯穿膜内外。结论推测华支睾吸虫乳酸脱氢酶不仅负责将糖酵解产生的丙酮酸转化为乳酸,而且还能将乳酸直接排出体外;可作为筛选水溶性抗华支睾吸虫药物的靶标;可介导特异性抗体对虫体的ADCC作用和补体的杀伤作用,以及对酶活性的抑制作用,是一个重要的疫苗侯选抗原。
- 胡旭初徐劲吕刚黄灿余新炳
- 关键词：华支睾吸虫乳酸脱氢酶生物信息学
- 华支睾吸虫F_0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析被引量：5
- 2007年
- 目的对华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基(CsF0-ATP-synt_B)基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。方法以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F0-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板,扩增该基因(去除线粒体靶向序列的成熟肽基因),将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-!-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠,制备抗血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基,编码271个氨基酸,相对分子质量(Mr)为31171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。
- 周红娟胡旭初胡凤玉徐劲马长玲郑小凌陈晓湘余新炳
- 关键词：华支睾吸虫基因克隆原核表达免疫原性
- 华支睾吸虫ATP合酶b亚基模拟亚细胞定位与细胞周期的关系被引量：2
- 2010年
- 目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)核定位序列(NLS)介导该蛋白进入细胞核与细胞周期的关系,及该蛋白对自身和宿主同源基因表达的影响。方法将已构建的CsATP-synt_B与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒(pEGFP-N1-CsATP-synt_B)转染Hela细胞,转染细胞经同步化处理后,在激光共聚焦显微镜下观察在不同细胞周期相,细胞不同部位的荧光分布。流式细胞技术检测该融合蛋白表达量的变化,并通过半定量RT-PCR分析不同细胞周期相CsATP-synt_B和Hela细胞同源基因的表达。结果转染细胞经同步化处理后,流式细胞检测结果显示,空载体pEGFP-N1在G0/G1期Hela细胞中的表达量明显下降,而pEGFP-N1-CsATP-synt_B在该时期表达量呈上升趋势;在其他细胞周期时相,两者的荧光表达量的变化趋势相似。显微镜观察发现,在G0/G1期、S期和G2/M期CsATP-synt_B集中在线粒体表达,G1/S期细胞核内见绿色荧光,且多数细胞的绿色荧光集中见于核仁。在不同的细胞周期,半定量RT-PCR分析结果显示,该重组蛋白进入细胞核后,目的基因CsATP-synt_B和人源性ATP-synt_B(Ho-moATP-synt_B)mRNA的表达均呈上升趋势,CsATP-synt_B上升幅度较大,但两者的表达变化趋势一致。结论 CsATP-synt_B在G1/S期进入细胞核,受细胞能量需求和细胞周期的调控。
- 周红娟余新炳徐劲胡凤玉黄灿赵俊红马长玲郑小凌胡旭初
- 关键词：华支睾吸虫细胞同步化亚细胞定位
