国家科技重大专项(2012ZX09201101-008)
- 作品数：25 被引量：37H指数：4
- 相关作者：洪文荣李继安林惠敏温淑平林强更多>>
- 相关机构：福州大学上海医药工业研究院上海师范大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程轻工技术与工程更多>>
- 万古霉素糖基转移酶GtfE的异源表达与体外活性检测
- 2013年
- 为了得到具有糖基转移酶活性的重组蛋白,从万古霉素产生菌总DNA中克隆万古霉素糖基转移酶基因gtfE,连入pET-37b构建表达质粒并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达,体外测定纯化后的重组蛋白糖基转移酶活性,用HPLC和ESI-MS检测反应产物。结果表明,重组蛋白具有预期活性,可以催化尿苷二磷酸葡萄糖与万古霉素苷元的糖基化反应。本研究为获得糖基多样性的万古霉素奠定理论基础。
- 王元希陈俊升邵雷李继安林惠敏陈代杰
- 关键词：万古霉素生物合成糖基转移酶异源表达
- 庆大霉素生物合成基因genD1的研究被引量：1
- 2014年
- 为研究genD1基因功能,在绛红色小单孢菌GK1101(Δgen K)上构建genD1基因缺失工程菌并分析其代谢产物组分变化。首先构建用于genD1基因框内敲除的同源重组质粒pGD14,经接合转移导入绛红色小单孢菌GK1101,经影印筛选获得genD1缺失工程菌GD1989。再发酵并提取其代谢产物,采用质谱法等检测代谢产物。结果表明,工程菌GD1989不再合成庆大霉素C1a和C2b,主要积累庆大霉素A。对工程菌GD1989喂养庆大霉素X2的发酵产物经检测含有庆大霉素C1a、C2b和JI-20A。genD1基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,说明genD1基因负责加洛糖胺C-4″位的甲基化。
- 陈洲琴林强胡育龙洪文荣
- 关键词：庆大霉素甲基化生物合成
- 响应面法优化产头霉素C发酵培养基
- 2014年
- 为研究头霉素C(1)产生菌链霉菌Streptomycin sp.OFR1022的发酵工艺,并提高1的产量,首先在单因素试验的基础上确定显著影响因素及其含量水平,再利用响应面分析法中的Box-Behken中心组合试验设计,优化产1发酵培养基中的显著影响因素,用Design Expert 8.0软件分析结果,得到较优培养基配方。在该条件下,1产量为1 905.6ug/ml,较优化前提高了68.3%,与预测值(1 984.03ug/ml)的相对误差为3.95%。
- 赵运霞林惠敏李继安陈代杰
- 关键词：链霉菌发酵响应面法
- 庆大霉素C1a生产过程中不同样品的HPLC法检测被引量：4
- 2016年
- 参照美国药典USP37-NF32版,采用柱前衍生化-HPLC法测定庆大霉素C1a(1)对照品及生产阶段的不同样品。在检测经离子交换树脂HZ-732富集后的洗脱液样品B时出现1个新的杂质峰,且检测所得1的浓度明显偏低。经LCMS分析,推测该杂质为邻苯二甲醛(OPA)不足的情况下1与巯基乙酸在碱性条件下的结合产物。经方法优化,通过稀释样品、增加衍生化试剂量及增加衍生化试剂中OPA的量,均可准确检测不同样品中1的浓度和纯度。向衍生化试剂中增加OPA,更适用于1发酵生产过程中不同阶段样品的检测。
- 丁碧粉张韬李继安陈代杰林惠敏
- 关键词：发酵柱前衍生化高效液相色谱
- 庆大霉素生物合成基因簇中抗性基因gmrB及gmrA的功能研究被引量：1
- 2018年
- 目的研究绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)G1008中抗性基因gmrB与gmrA功能,为阐明庆大霉素生物合成机制奠定基础。方法以红霉素抗性基因ermE分别置换gmrB和gmrA基因,构建突变株GerB102和GerA102。借助TLC和MS分析突变株代谢产物是否变化,同时检测突变株耐受自身代谢产物的能力是否发生变化。结果突变株GerB102代谢产物没有发生明显变化,仍主要积累庆大霉素C化合物,而GerA102代谢产物发生变化。庆大霉素耐受性试验结果显示,GerB102和G1008耐庆大霉素浓度达到6000U/m L以上,而GerA102不足50U/m L。结论 gmrB既非庆大霉素生物合成的关键基因,也非关键的抗性基因,而gmrA是庆大霉素抗性的关键基因。
- 万云凤连榕洪文荣石贤爱
- 关键词：庆大霉素基因工程
- 庆大霉素生物合成基因genN的研究
- 2015年
- 利用生物信息学方法分析庆大霉素生物合成特色基因gen N的功能,构建gen N缺失的基因工程菌。首先运用分子生物学技术构建同源重组质粒p FU604,其次重组质粒经接合转移导入绛红色小单孢菌M.purpurea GK1101。最后,基于同源重组机制,利用安普霉素抗性筛选及PCR鉴定,得到gen N基因缺失的工程菌(M.purpurea GKN-27)。结果显示:较岀发菌GK1101,基因工程菌GKN-27不再继续合成庆大霉素C1a和C2b,阻断庆大霉素生物合成代谢流,并积累分子量为497、524、523、503四种新的中间代谢物,新的中间代谢物将有望开发新型药物。同时,也表明gen N不是C-6'N甲基化酶编码基因。
- 张熠洪文荣潘成奇
- 关键词：庆大霉素基因敲除工程菌构建生物信息学
- 一株主产庆大霉素C2a工程菌的构建
- 2016年
- 为更好生产单组分庆大霉素C2a,拟构建一株主产庆大霉素C2a的工程菌.通过序列比对分析,锁定genB2为构建该工程菌的关键基因.以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genB2的上下游序列为同源交换臂,构建同源重组质粒pZB303.通过接合转移,将质粒pZB303导入绛红小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选得到一株genB2框内缺失工程菌GB102.发酵并提取代谢产物,再经TLC,HPLC,MS分析.结果表明,工程菌GB102主要积累庆大霉素C2a.有望用于生产单组分庆大霉素C2a.
- 林强陈洲琴阙新桥洪文荣
- 基于秀丽隐杆线虫耐药菌感染模型筛选活性化合物被引量：4
- 2014年
- 目的建立秀丽隐杆线虫—甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌感染模型,筛选抗耐药菌感染的活性化合物。方法利用耐药菌对线虫进行感染,建立液体条件感染和抗生素救治模型,通过观察感染线虫的存活情况,考察筛选样品活性。结果对456个样品进行考察,发现化合物sipi8294在浓度为16μg/mL时,可以使感染线虫存活率达到60%左右。通过联合用药实验发现,8μg/mL sipi8294和8μg/mL氨苄西林联用,可以使线虫存活率提高到80%以上(vs.8μg/mL氨苄西林组,P<0.01)。sipi829 4与青霉素类药物联用,具有明显的增效作用。结论该模型能反映病原菌在线虫体内的耐药性,并可以用于化合物的筛选,发现具有抗感染或是辅助抗感染作用的化合物。
- 周雨朦李继安沈舜义林惠敏葛涵朱春宝陈代杰
- 关键词：秀丽隐杆线虫耐药菌抗感染
- aprK基因敲除的氨甲酰妥布霉素工程菌的构建被引量：2
- 2013年
- 以温敏型穿梭质粒pKC1139为基础,克隆安普霉素辛二糖合成酶基因aprK上下游序列作为同源交换臂,构建用于敲除aprK的重组质粒pBK5。pBK5转化E.coli ET12567后经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换菌株ST315。ST315经松弛传代后通过影印培养与PCR筛选得到aprK阻断突变株ST316。ST316发酵效价约1 500 ug/mL,发酵产物经TLC分析,发现安普霉素的生物合成被阻断,得到了一株主要产氨甲酰妥布霉素的工程菌。
- 李辉温淑平洪文荣
- 关键词：黑暗链霉菌安普霉素基因工程
- 庆大霉素C-6'位氨甲基化修饰基因的研究
- 2015年
- 探索庆大霉素C-6'位氨甲基化修饰作用的基因。首先构建用于gen T基因缺失的同源重组质粒p FT104,利用接合转移导入绛红色小单孢菌G1008,筛选获得一株gen T基因缺失工程菌GT106(Δgen T)。其次构建用于GT106上gen N基因缺失的重组质粒p FTN203,通过接合转移导入GT106,筛选获得一株工程菌GTN205(Δgen T+gen N)。最后在gen K基因已经明确为C-6'位甲基化酶基因的基础上,在GTN205中敲除gen K基因,筛选获得到一株工程菌GTNK308(Δgen T+gen N+gen K)。工程菌发酵产物经质谱分析结果表明,与出发菌G1008相比,GT106组分未发生变化,而GTN205不再合成庆大霉素C1,产物主要积累在庆大霉素C1a和C2,GTNK308未检测到庆大霉素C2b。结果说明,gen N基因缺失阻断了庆大霉素C1与C2b的合成,表明gen N基因参与修饰绛红糖胺C-6'位氨甲基化,而gen T并不参与修饰绛红糖胺C-6'位氨甲基化。
- 胡育龙洪文荣
- 关键词：庆大霉素修饰
