国家自然科学基金(31070698)
- 作品数：15 被引量：9H指数：2
- 相关作者：孟清陈格飞林瑛李佳贾小娜更多>>
- 相关机构：东华大学吉林大学白求恩第一医院达尔豪斯大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程更多>>
- 利用搭桥PCR技术对蛋白质内含子HP进行改造(英文)被引量：1
- 2012年
- [目的]利用搭桥PCR技术对蛋白质内含子HP进行改造。[方法]根据搭桥PCR中寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板的原则设计多对引物,通过多次PCR扩增获得目的基因片段,进而实现对蛋白质内含子HP在基因水平上进行多个位点同时定点突变和添加Linker。[结果]搭桥PCR产物克隆经DNA测序分析,证明蛋白质内含子HP内部的4个半胱氨酸成功突变成丝氨酸,几个PCR前体片段也无缝的融合成HP基因片段,而且没有引进任何其他突变;经DNA测序,46bp的DNALinker成功的插入到设计好的HP基因序列中,且没有任何碱基突变和错配。[结论]该研究不仅实现了对蛋白质内含子HP的快速改造,而且扩大了搭桥PCR的应用范围,同时也为蛋白质内含子的基础改造提供了低成本、简捷、高效的方法。
- 李佳林瑛张秀丽扬子江贾秋品孟清
- 关键词：引物设计
- 利用小肽控制的基于蛋白质内含子非层析标签制备重组蛋白(英文)
- 2014年
- 基于蛋白质内含子的蛋白质纯化自我断裂标签已经被广泛使用超过15年之久.但这一系统体内表达过程的提前断裂一直是限制这一技术广泛应用的瓶颈,特别是在需要高温表达和长表达周期的真核表达系统中.本研究介绍了一种利用小肽控制的基于蛋白质内含子和非层析标签ELP(elastin-like polypeptide)的自我断裂系统.在这一系统中,蛋白质内含子的体内外活性严格受到其结构互补小肽控制.在体内表达不含有互补小肽时,蛋白质内含子不具有活性;而在体外添加结构互补小肽,蛋白质内含子结构恢复并发生C端断裂反应释放目的蛋白.由于非层析标签ELP的引入,因此整个纯化过程可以简单地通过几步机械沉淀完成.此外,这一系统反应pH、小肽与前体蛋白之间的摩尔比及断裂速率也一并进行了系统的研究.
- 施长华孟清Wood D W
- 关键词：小肽蛋白质内含子蛋白质纯化
- 多种S1断裂内含肽间的体内交叉反应(英文)
- 2013年
- 断裂内含肽含有两个独立分离的多肽片段(N端内含肽和C端内含肽),它催化蛋白质反式剪接反应,在蛋白质研究与蛋白质工程中已得到诸多实际应用.在蛋白质反式剪接过程中,内含肽的N端内含肽和C端内含肽通过结构互补特异性地非共价组合.然而,Ssp DnaX S1型断裂内含肽的较大C端内含肽片段近来被发现能够与源自其它内含肽的N端内含肽片段交叉反应,表明蛋白质内含子Ssp DnaX具有结构杂交特征.本研究对另外2种S1型内含肽RmaDnaB和Ssp Gyr B的较大C端内含肽与不同S1型断裂内含肽的N-端内含肽交叉反应活性进行分析检测.目的是探讨S1型断裂内含肽的结构杂交特征是否具有普遍性.结果发现,Rma DnaB的S1C端内含肽能够与Ssp GyrB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1N端内含肽交叉反应;与此相似,Ssp GyrB的S1C端内含肽能够与Rma DnaB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1N端内含肽交叉反应.此外,某些交叉反应表现出温度依赖性.这些结果对于内含肽的结构-功能关系以及S1型断裂内含肽的应用研究具有重要的意义.
- 宋慧玲刘相钦孟清
- 关键词：蛋白质反式剪接
- 次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究被引量：2
- 2014年
- 蜘蛛丝是天然的生物材料,具有潜在的巨大应用价值。研究蜘蛛丝蛋白质的结构与功能,有助于破解蜘蛛丝蛋白质的成丝机理,为制备优良材料学性能的仿生蜘蛛丝纤维提供理论依据。以MiSp蜘蛛丝的重复区和C端非重复区蛋白多肽为研究对象,在不同pH值和离子条件下,在体外研究其二级结构与成丝的关系。CD图谱显示:表达纯化的重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH 7.5、6.5和5.5时二级结构相似,均为无规则卷曲,而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象;扫描电镜结果表明:在以上3种pH条件下,只有pH 5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维,R1R2CT纤维形态较平整,类似于天然蛛丝纤维形态,而R1R2丝纤维则呈条带状,表面粗糙。另外,氯化钠不利于形成形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础,也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。
- 贾小娜陈格飞孟清
- 关键词：Α螺旋纤维
- 应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端被引量：1
- 2014年
- 蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%.
- 戴旭东李佳刘相钦孟清
- 关键词：蛋白质剪接荧光基团
- 大腹园蛛主壶腹腺丝基因的筛选及序列分析被引量：1
- 2015年
- 为研究蛛丝蛋白编码基因和蛋白的组成结构模式、进化,并为蛛丝仿生提供更多的基因资源,运用3D/PCR(three-dimensional polymerase chain reaction)技术对大腹园蛛(A.ventricosus)Fosmid基因组文库进行主壶腹腺丝(MaSp1)编码基因的筛选,并对部分序列进行分析.通过筛选实验室前期构建的Fosmid文库获得含有MaSp1基因的阳性克隆Av11-19-5,通过shotgun测序得到MaSp1部分基因序列MaSp1RC.MaSp1RC长786bp,编码的262个氨基酸(AvMaSp1RC)可划分为保守的C端非重复区(CT)和重复区(Rep).Rep主要由poly-Ala,Glyx和GlyGlyx等模块组成,Ala和Gly含量占总氨基酸的78%;CT中参与形成离子键的氨基酸及helix 4上的疏水模块高度保守.研究结果为蛛丝蛋白二聚化及仿生学研究提供了更多的基因资源.
- 张雪陈格飞孟清
- 关键词：大腹园蛛
- Euprosthenops australis牵引丝蛋白的原核表达
- 2013年
- 参照GenBank收录的牵引丝蛋白编码序列,经过密码子优化,人工合成3段cDNA序列:NT、CT和4Rep,由Ⅰ型限制性内切酶BsaⅠ和BspMⅠ介导无缝拼接,分别构建4RepCT、NT4RepCT、NT8RepCT和NT12RepCT重组模块.通过改造表达载体和优化培养温度,成功提高了4RepCT的表达量(30 mg/L).另外还首次成功表达NT4RepCT和NT8RepCT重组蛋白模块,表达量分别为21 mg/L和8.5 mg/L.4RepCT表达量的提高及NT4RepCT和NT8RepCT的成功表达证实了融合标签TRX有利于提高蛛丝蛋白的表达水平,为E.australis全长牵引丝蛋白的表达奠定了基础.
- 张秀丽陈格飞林瑛李佳孟清
- 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达
- 大腹园蛛次壶腹腺丝的表达被引量：2
- 2013年
- 基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。
- 杨子江陈格飞孟清
- 关键词：毕赤酵母表达系统大肠杆菌表达系统
- 蛛丝蛋白MiSp重组模块R1R2CT表达及其纤维化动力学研究被引量：1
- 2015年
- 为探索蛛丝蛋白模块单元在成丝过程中的作用,研究了大腹园蛛MiSpR1R2CT功能模块在不同pH条件下的纤维化动力学特性。大腹园蛛MiSp蛋白的R1R2CT功能模块与硫氧还蛋白融合,并在BL21（DE3）中进行表达,表达量约为15mg/LLB培养基。R1R2CT蛋白在pH7.5和6.5时较为稳定,在22h之内不发生纤维化;当pH值降至5.5时,R1R2CT在前2h内快速纤维化,3～5h趋势较为平缓;5h之后R1R2CT蛋白再次出现ThT信号的快速增长,7h后保持缓慢增长至22h。R1R2CT的增长速率及幅度高于单独的CT（C-termi-nal）蛋白,而单独的R1R2在pH7.5、6.5和5.5时均保持稳定,表明重复区依赖CT模块的快速纤维化模式。已有研究表明,CT在重复区纤维化过程中起晶核作用,该成果也从反面证实CT的晶核理论。
- 王锋陈格飞孟清
- 关键词：晶核
- 定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3剪接活性的研究
- 2012年
- 目前,蛋白质内含子在蛋白质工程领域中得到越来越广泛的应用。为提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3(Trichodesmium erythraeum)在异源宿主中的剪接活性,采用易错PCR技术,通过改变反应体系中dNTP、Mg2+、Mn2+的浓度等手段,借助依赖卡那霉素的蛋白质内含子筛选系统进行筛选。Western印迹结果表明:通过定向进化,其中5号突变体的剪接活性从原始的约20%提高至约85%;9号突变体能够避免发生剪接副反应,即N端断裂反应。氨基酸突变位点与剪接活性变化的相关性分析表明:参与α-helix形成的氨基酸的突变极有可能影响蛋白质内含子的断裂反应,参与β-sheet形成的氨基酸的突变则有可能影响蛋白质内含子结构的紧凑性。通过定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3在异源宿主中的剪接活性,进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性,为扩大蛋白质内含子的应用范围奠定基础。
- 荀启静林瑛邱沛然孟清
- 关键词：蛋白质内含子定向进化蛋白质剪接
