广西壮族自治区科技攻关计划(0992033-5)
- 作品数：12 被引量：87H指数：6
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- 牛病毒性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立被引量：34
- 2010年
- 目的:建立牛病毒性腹泻病毒(BVDv)的环介导体外等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:根据BVDv的5'端非编码区序列,在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物(2对特异性引物和1对环引物),对反应条件和试剂浓度进行优化,建立恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法。结果:建立的方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。结论:建立了用于检测BVDv的LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒
- 牛轮状病毒二温式PCR检测方法的建立被引量：6
- 2010年
- 根据牛轮状病毒(Bovine rotavrius,BRV)的群特异性基因VP6设计了1对特异引物,建立并优化了能够快速检测BRV的二温式PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,该二温式PCR只对BRV敏感,可扩增获得大小为385 bp的特异性条带,其敏感性为最低能检测到1 pg的BRV RNA;而对其他病毒不敏感。说明所建立的BRV二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词：牛轮状病毒二温式PCR
- 牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较被引量：4
- 2012年
- 利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒反转录-聚合酶链反应
- 牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达被引量：4
- 2013年
- 利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基罗思思
- 关键词：牛轮状病毒VP7蛋白昆虫细胞
- TaqMan实时荧光PCR快速检测牛病毒性腹泻病毒
- 根据GenBank公布的牛病毒性腹泻(BVD)5′端非编码区核苷酸序列,本研究设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了用于检测BVDV的实时荧光定量PCR方法。特异性试验表明,该方法只能检测到BVDV,而与CSFV、B...
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR
- 文献传递
- 牛轮状病毒RT-LAMP快速检测方法的建立被引量：3
- 2010年
- 本研究旨在建立一种快速可视化检测牛轮状病毒(BRV)的反转录-环介导恒温扩增方法(RT-LAMP)。根据BRV的群特异性基因VP6设计一套LAMP引物,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了恒温(63.5℃)、快速(45 min)的检测方法。结果显示:所建立方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,扩增产物经酶切分析结果正确,扩增结果可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定。建立了用于检测BRV的RT-LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词：牛轮状病毒扩增方法特异性基因浑浊度反转录
- 牛轮状病毒三种核酸检测方法的比较被引量：6
- 2012年
- 利用针对牛轮状病毒(BRV)的普通PCR、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)三种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行检测,比较三种核酸检测方法的检出结果。三种核酸检测方法中LAMP最敏感敏感,能检测到1拷贝/μL,Real-time PCR能检测到100拷贝/μL,普通PCR只能检测到1×104拷贝/μL。但结合临床样品检测表明:常规PCR方法敏感度低会造成一部分漏检,LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较三种方法后,推荐用LAMP结合real-time PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛轮状病毒的检出率。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基
- 关键词：牛轮状病毒RT-PCR实时荧光PCRRT-LAMP
- 牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：20
- 2010年
- 根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR
- 牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达被引量：4
- 2013年
- 为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒。将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2。转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析。结果表明,重组E2蛋白大小为43.6ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基罗思思
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒E2蛋白昆虫细胞
- 牛病毒性腹泻二温式PCR检测方法的建立被引量：4
- 2010年
- 根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5’端非编码区设计了1对可以扩增244bp BVDV某段基因序列的特异性引物,优化建立了BVD的二温式PCR快速检测方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;最低能检测到1pg牛病毒性腹泻病毒RNA。本研究所建立的BVD二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。
- 范晴谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词：牛病毒性腹泻二温式PCR
