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荧光PCR探针熔解分析法检测质粒介导ampC耐药基因的应用与评价被引量：2: 2016年; 目的探讨多重荧光PCR-探针熔解分析法应用于临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ampC耐药基因的检测方法,并评价该方法的临床应用价值。方法收集医院2009年7月-2010年6月的临床分离菌株,首先采用头孢西丁纸片法进行耐药表型筛选,再同时应用传统PCR技术与荧光PCR-探针熔解曲线法对临床分离菌株进行检测,并对ampC耐药基因扩增产物进行DNA测序。结果经头孢西丁纸片法筛选出176株对头孢西丁不敏感临床分离菌株,其中97株为肺炎克雷伯菌、79株为大肠埃希菌;在176株临床分离株中,荧光PCR-探针熔解分析法检测出36株ampC耐药基因阳性菌株,包括18株DHA型、12株CIT型和5株EBC型,还有1株肺炎克雷伯菌同时含有DHA型和EBC型;而传统PCR技术检出32株ampC耐药基因阳性,两个检测结果的符合率为97.7%;DNA测序后经BLAST比对,荧光PCR-探针熔解分析法检测ampC基因型与所检测目的基因型一致。结论荧光PCR-探针熔解分析法能高效检测出质粒介导ampC耐药基因,其方法简便、敏感性高、特异性强,具有良好的临床应用价值。; 郑港森刘赞赞张加勤宋秀宇李庆阁黄朝阳马晓波房丽丽; 关键词：AMPC酶肺炎克雷伯菌

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建被引量：1: 2015年; 目的构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3′、5′侧翼序列,将clpP基因及其3′、5′侧翼序列克隆至pMD19T载体,EcoRV切除clpP基因37bp^453bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。; 张加勤饶慧华徐巧丽黄朝阳房丽丽马晓波宋秀宇; 关键词：铜绿假单胞菌同源重组

clpC 基因对变异链球菌感受态形成的影响: 2015年; 目的：构建变异链球菌clpC缺陷突变株，检测该基因对变异链球菌感受态形成的影响。方法分别以变异链球菌UA159基因组和pIB107质粒为模板，PCR扩增clpC基因片段和卡那霉素基因盒（lox71-KMR-lox66）；将clpC基因片段插入pMD-19T simple载体，经ClaⅠ／EcoRⅠ酶切、补平后连入卡那霉素基因盒，构建clpC缺陷突变同源重组载体pCKX2；SalⅠ线性化pCKX2并转化变异链球菌，卡那霉素筛选阳性菌落；质粒pCrePA转化阳性菌株，30℃培养剔除卡那霉素基因盒；37℃培养去除pCrePA，获得clpC缺陷突变株，PCR和测序鉴定；提取细菌总RNA并逆转录成cDNA，用RT-PCR法扩增clpC缺失序列的核苷酸片段并进行产物的电泳分析；pDL276分别转化变异链球菌和clpC缺陷突变株，观察感受态细胞形成变化。结果 PCR和测序结果证实成功构建同源重组载体pCKX2及变异链球菌clpC缺陷突变株；RT-PCR结果显示，△clpC缺失的核苷酸片段PCR产物电泳结果并无相应的条带出现；clpC缺陷突变株的感受态形成期延迟并延长维持期。结论 clpC基因具有负调控变异链球菌晚期感受态细胞形成的作用。; 徐巧丽饶慧华马晓波黄朝阳郑港森张加勤宋秀宇; 关键词：变异链球菌感受态细胞

医院感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的SCCmec分型及同源性研究被引量：5: 2014年; 目的研究多重耐药的甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）菌株的SCCmec基因分型,并对菌株进行同源性分析。方法纳入26株耐药谱相同的MRSA菌株,采用多重PCR检测SCCmec的分型;应用Rep-PCR法采用DiversiLb系统对菌株进行同源性分析。结果 26株MRSA的SCmec多数为Ⅲ型,占84.6%,另检出Ⅱ型2株、Ⅳ型1株,1株未能分型;未发现I型SCCmec。DiversiLab分析结果显示MRSA可分为10组,同源性介于40%～100%。其中SCCmee-Ⅱ亚型2株完全相同。SCCmec-Ⅲ亚型subtype 1型相似性在90%以上;subtype 3型4株为同一组、MRSA相似性在95%以上;subtype 2型可分为5组,相似性在90%以上。结论医院感染多重耐药的MRSA多数以SCCmec-Ⅲ型为主,医院内存在一定流行,应引起临床医师及感染控制部门重视。; 马晓波侯舒毅徐和平赵元勋张加勤房丽丽宋秀宇; 关键词：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌多重聚合酶链反应基因分型

胆道感染病原菌的分布及耐药性分析被引量：15: 2014年; 目的了解胆道感染病原菌的分布及其耐药性，为临床使用抗菌药物提供依据。方法医院2008年1月-2012年8月的胆汁标本经BacT／ALERT120全自动血培养仪培养检测，对检出的病原菌采用VITEK-2Compact全自动微生物鉴定药敏仪进行细菌鉴定及药敏分析。结果共分离到病原菌305株，其中革兰阴性杆菌占69．84％，革兰阳性球菌占27．54％，真菌占2．62％，排名前5位病原菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌，分别占29．18％、12．13％、11．48％、6．89‰、5．90％，大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的检出率分别为47．19％和21．62％；大肠埃希菌对青霉素类、喹诺酮类、部分第三代头孢菌素类的耐药率较高，为48．86％～69．32％，对阿米卡星、亚胺培南有较低的耐药率；铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素和哌拉西林／他唑巴坦的耐药率较低，〈12．00％，粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率为2．94％，未检出对万古霉素、替考拉宁耐药的菌株；屎肠球菌对糖肽类药物的耐药率为4．76％～9．52％。结论医院致胆道感染病原菌以革兰阴性菌为主，混合感染多见，采用对大肠埃希菌耐药率低的广谱抗菌药物用于治疗胆道细菌感染。; 黄加铭张加勤马晓波宋秀宇; 关键词：胆道疾病胆汁耐药性

变异链球菌ldh基因启动子的克隆及活性检测被引量：1: 2016年; 目的克隆变异链球菌ldh基因启动子,并验证其活性。方法以变异链球菌UA159基因组为模版,PCR扩增变异链球菌ldh基因候选启动子,将其插入β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,gusA)报告基因表达载体pIB107 BamH I/XhoI之间,构建ldh基因启动子gusA报告载体pCKS11,PCR、酶切及测序鉴定;经ScaI酶线性化后转化变异链球菌UA159,卡那霉素筛选阳性克隆SCKS11,经PCR和测序鉴定后,检测其GusA活性。结果成功扩增出大小为269bp的ldh基因候选启动子;经PCR、酶切及测序鉴定,变异链球菌ldh基因候选启动子gusA报告基因表达载体pCKS11构建正确;PCR和测序鉴定,ldh基因候选启动子gusA报告株SCKS11构建成功;变异链球菌ldh基因候选启动子启动的GusA活性是无启动子的阴性对照的5.8倍,是阳性对照变异链球菌clpP基因启动子的0.9倍。结论成功克隆变异链球菌ldh基因启动子序列,具有较强的启动转录活性,为研究ldh基因的表达调控机制奠定基础。; 张加勤黄珊珊徐巧丽饶慧华马晓波黄朝阳房丽丽郑港森宋秀宇; 关键词：变异链球菌启动子

变异链球菌腺苷磷酸硫酸酶的原核表达及功能研究: 2012年; 目的构建变异链球菌aps基因原核表达载体,表达纯化目的蛋白,继而对其生物学功能进行初步鉴定。方法以变异链球菌UA159株基因组DNA为模板PCR扩增变异链球菌aps基因编码区,插入原核表达载体pASK-IBA43plus,转化E.coli Top 10,无水四环素诱导His-APS蛋白表达,经Ni-NTA纯化后,检测His-APS蛋白腺苷磷酸硫酸酶活性及核糖核酸酶活性。结果 PCR扩增出933bp的aps基因开放读码框,成功构建aps基因原核表达载体pASK-aps,并在E.coli Top 10中诱导表达,SDS-PAGE检测重组His-APS蛋白分子质量单位为38ku,该蛋白在Mg2+及Mn2+存在条件下能水解pAp,且呈时间及浓度依赖性,但不能降解Cy5标记的随机6nt寡核苷酸探针。结论重组His-APS蛋白具有腺苷磷酸硫酸酶活性,呈时间及浓度依赖性,但不具有核糖核酸酶活性。; 张加勤侯香华宋秀宇; 关键词：变异链球菌核糖核酸酶

维持血液透析患者血清铝负荷及其相关因素研究被引量：11: 2015年; 背景铝在人体内的蓄积给维持血液透析患者带来了严重危害,然而目前国内对血液透析患者血清铝水平的大规模调查尚不多见。目的检测福建省慢性肾衰竭维持血液透析患者血清铝水平,探讨影响血清铝水平的因素。方法收集2012年1月—2013年12月福建省厦门市、漳州市、龙岩市、泉州市、三明市15所医院透析中心慢性肾衰竭维持血液透析患者和健康体检者血清标本,共收集慢性肾衰竭维持血液透析患者449例,健康体检者262例,采用AA800原子吸收光谱仪检测血清中铝水平。采用多重线性回归分析影响慢性肾衰竭患者血清铝水平的因素。结果慢性肾衰竭维持血液透析患者血清铝水平为(18.34±6.16)μg/L,高于健康对照者的(1.57±0.45)μg/L(t=2.324,P<0.05)。52例(11.6%)慢性肾衰竭维持血液透析患者血清铝水平超过了国际肾脏病组织推荐的慢性肾衰竭患者血清铝允许上限值(30μg/L)。男性慢性肾衰竭维持血液透析患者血清铝水平为(18.45±6.48)μg/L,女性为(18.22±5.64)μg/L,两者比较,差异无统计学意义(t=1.058,P>0.05)。各透析中心透析液及所在城市饮用水铝水平比较,差异有统计学意义(F=4.252、3.316,P<0.05)。服用磷结合剂、Vit D制剂、注射促红细胞生成素(EPO)及近期接受输血治疗的血液透析患者血清铝水平高于未接受上述治疗患者(P<0.05)。慢性肾衰竭维持血液透析患者中不同饮茶量、食加工面食比例者血清铝水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);不同食肉食比例患者血清铝水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。多重线性回归结果显示,饮茶量、面食饮食、饮用水铝含量、每日尿量、透析频率、透析液铝含量、服用磷结合剂、服用Vit D、注射EPO、输血为影响慢性肾衰竭患者血清铝水平的因素(P<0.05)。结论福建省慢性肾衰竭维持血液透析患者铝负荷较高,饮食习惯、治疗措施及透析情况影响�; 侯香华张加勤邵思南李弋南周凌辉张燕林; 关键词：肾透析

3年主要革兰阴性菌的耐药性变迁被引量：3: 2014年; 目的：分析临床分离的常见革兰阴性菌的分布及耐药情况，为临床使用抗菌药物提供依据。方法收集2010年1月至2012年12月临床标本中检出的革兰阴性菌，分析其分布及耐药情况。结果3年间共检出革兰阴性菌8258株，前4位是大肠埃希菌（2227株，27．0％），肺炎克雷伯菌（1363株，16．5％），铜绿假单胞菌（1141株，13．8％），鲍曼不动杆菌（1078株，13．1％）。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌株的总检出率分别为50．6％和38．3％，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南敏感率最高，值得注意的是肺炎克雷伯非ESBLs菌株对大部分三代头孢菌素类的耐药率呈逐年上升趋势。铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗菌药物、头孢吡肟和哌拉西林／他唑巴坦的敏感率均较高，分别为83．0％～96．4％、81．2％～82．8％和90．0％～94．7％，鲍曼不动杆菌对大多数抗菌药物的耐药率有逐年下降趋势。结论临床数据显示，细菌耐药性的变化是不可预测的，连续性监测对动态掌握抗菌药物的耐药趋势以指导抗菌治疗是必要的。; 黄加铭马晓波张加勤宋秀宇; 关键词：革兰阴性菌抗菌药物

弓形虫乳酸脱氢酶LDH2基因启动子的克隆及鉴定: 2013年; 目的克隆弓形虫乳酸脱氢酶LDH2基因启动子并进行初步鉴定。方法 PCR扩增出LDH2基因5′侧翼序列系列截短突变体,定向插入载体pTX3–basic的Kpn I/Xhol I酶切位点之间,转化大肠埃希菌Top 10,氨苄西林筛选,建立重组LDH2基因5′侧翼序列系列截短突变体荧光素酶表达载体。转染刚地弓形虫速殖子,利用荧光素酶检测试剂盒测定所克隆片段的启动转录活性。结果成功扩增出LDH2基因5′侧翼序列系列突变体;系列重组荧光素酶表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确无误;系列重组荧光素酶表达质粒在弓形虫速殖子中的相对活性与阴性对照pTX3-basic基本相同,而在弓形虫缓殖子中,除pTX3-293和pTX3-193外,其他重组荧光素酶活性均是阴性对照pTX3-basic的40～50倍之多,是阳性对照pTX3-control的1.2～1.5倍,说明插入片段具有较强的启动子活性。结论成功定位并克隆弓形虫LDH2基因启动子,为今后研究LDH2基因上游调控序列提供试验和理论依据。; 张加勤侯香华宋秀宇; 关键词：弓形虫乳酸脱氢酶启动子荧光素酶

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