山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(2006BS06015)
- 作品数：9 被引量：31H指数：3
- 相关作者：胡敬东赵宏坤李宏梅苏倩倩李恩扩更多>>
- 相关机构：山东农业大学聊城大学济南军区疾病预防控制中心更多>>
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- 人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白复性过程中研究的影响因素
- 2009年
- 将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性。然后按照试验设计,考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明,利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性,为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了基础。
- 王新华胡敬东孔娜李宏梅赵宏坤
- 关键词：复性
- 鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用
- 2014年
- 应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白(Mature chicken interleukin-18,mChIL-18)的2株单克隆抗体(mAb)1G9和2E6,建立检测mChIL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg/L,检测抗体的工作效价为1∶800,待检样品的最佳稀释度为1∶400,检测敏感度可达31.5ng/L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著(P<0.05)。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。
- 王肖祎苏倩倩李恩扩胡敬东
- 关键词：单克隆抗体双抗体夹心ELISA
- 鸡白细胞介素18成熟蛋白的原核表达及抗体间接ELISA方法的建立
- 2012年
- 将鸡白细胞介素18的成熟蛋白(chicken interleukin 18 mature protein,mChIL-18)基因在原核系统表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化得到该重组蛋白。纯化后重组蛋白包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、羊抗鼠酶标二抗稀释倍数,建立检测ChIL-18成熟蛋白抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定结果确定最佳抗原包被质量浓度为4μg/ml,阳性血清稀释比例为1∶104,羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释比例为1∶12 000,抗原抗体最佳结合时间是1.5 h,血清与二抗最适反应时间为1 h。阴性、阳性血清的判定标准为:被检样本的OD值是一组阴性样本OD值的2或3倍且OD450≥0.5,即为阳性,比值以P/N表示1,.5
- 苏倩倩李恩扩张海滨周霞胡敬东
- 关键词：原核表达蛋白纯化间接ELISA
- 鸡白细胞介素18成熟蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达及其活性检测被引量：1
- 2011年
- 首先将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18,mChIL-18)基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,然后转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌E.coli DH10BacTM中,构建重组Bacmid(rBacmid)。通过脂质体介导法将纯化的rBacmid转染sf9细胞,获得完整重组杆状病毒,将达到一定滴度的重组杆状病毒感染sf9,收获感染后不同时间段的培养上清和细胞,经SDS-PAGE分析、Western-blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,分子量约为23KDa的重组蛋白在昆虫细胞中获得了表达;鸡淋巴细胞转化试验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验表明,表达产物具有良好的生物学活性。结论:在杆状病毒表达系统中成功表达了有活性的mChIL-18蛋白。
- 范忠玲王婷婷马凤龙胡敬东
- 关键词：昆虫细胞生物学活性
- 重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)对MDV感染SPF鸡细胞免疫的影响被引量：9
- 2007年
- 用马立克氏病病毒(MDV)感染5日龄SPF鸡后,取21日龄和35日龄鸡的淋巴细胞,运用3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞对ConA和重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)的反应,并用MTT法检测NK细胞和CTL对MD肿瘤细胞系CU147的杀伤活性及rChIL-18和IFN-γ对它们的作用。结果显示,SPF鸡感染MDV后淋转水平显著下降,NK细胞、CTL杀伤活性在感染后21日龄时升高,而在35日龄时NK细胞杀伤活性显著下降。rChIL-18对对照组和感染组SPF鸡的淋转水平和杀伤活性均有提高作用,同样IFN-γ也具有提高NK细胞和CTL杀伤活性的作用。
- 李宏梅胡敬东郭慧君郑玉姝刘翠艳田兆菊赵宏坤
- 关键词：细胞杀伤活性细胞免疫SPF鸡
- 鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定被引量：1
- 2013年
- 将鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin 18,mChIL-18)基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌中高效表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb),并通过间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)和Western blot等方法对mAb做初步鉴定。结果表明,试验成功表达了mChIL-18蛋白,并获得2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(1G9、2E6),其腹水ELISA效价分别为1:5.12×105和1:3.2×104,亚类鉴定结果均为IgM。Western blot结果显示,2株单抗均能特异性识别原核表达的mChIL-18蛋白,IFA分析表明它们均能与真核表达的mChIL-18发生特异性反应,ELISA叠加试验证实1G9与2E6针对2个不同的抗原表位。本研究所获单抗可以用于建立鸡IL-18的检测方法,为进一步开展其生物学功能研究奠定了基础。
- 苏倩倩王肖祎李恩扩彭志成胡敬东
- 关键词：鸡白细胞介素18单克隆抗体特异性鉴定
- 灰斑病菌入侵对不同抗性玉米品种保护酶活性的影响被引量：12
- 2009年
- 为从分子生物学角度进一步揭示玉米对灰斑病抗性的生理机制提供理论依据,利用紫外可见分光光度计,采用比色(酶活测定)法,研究了玉米灰斑病菌侵入对不同抗性玉米品种保护酶活性的影响。结果表明,玉米灰斑病菌侵入后不同抗性玉米品种体内的保护酶活性均发生一定的变化:POD活性增加、CAT活性降低,酶活增加(或降低)的幅度和提高(或降低)率与寄主的抗感性关系不密切;EST活性提高,抗病品种酶活增加的幅度和提高率比感病品种高;SOD活性增加,且感病品种SOD酶活增加的幅度比抗病品种高;PPO活性增加,感病品种酶活提高率较高,而中抗和高抗病品种酶活提高率较低。说明玉米在遭到病菌侵入时,体内会产生相应的反应来减轻危害。
- 王桂清赵培宝杜学林邢光耀
- 关键词：玉米品种玉米灰斑病菌保护酶
- 人工分子伴侣辅助鸡白细胞介素18重组蛋白的复性被引量：1
- 2008年
- 目的:研究表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和β-环糊精(β-CD)组成的人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性,以提高鸡IL-18重组蛋白复性率,获得更多具有良好活性的蛋白。方法:将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性,然后利用人工分子伴侣系统辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后,利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。结果:经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性,鸡IL-18重组蛋白获得了42·54%复性率。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。结论:人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性,获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。
- 王新华胡敬东孔娜李宏梅赵宏坤
- 关键词：Β-环糊精复性表面活性剂
