山东省自然科学基金(ZR2012CQ025)
- 作品数：8 被引量：16H指数：2
- 相关作者：柳学周徐永江史宝王妍妍刘芝亮更多>>
- 相关机构：中国水产科学研究院黄海水产研究所上海海洋大学青岛贝宝海洋科技有限公司更多>>
- 发文基金：山东省自然科学基金国家高技术研究发展计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 星突江鲽胰岛素样生长因子I的体外重组表达及生物活性分析
- 2015年
- 为了在蛋白水平认识星突江鲽(Platichthys stellatus)胰岛素样生长因子I(IGF-I)的生长调控作用及机制,采用RT-PCR方法扩增了其成熟肽片段,利用原核表达载体p ET-28a成功构建了重组星突江鲽IGFI/p ET-28a质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的重组星突江鲽IGFI蛋白。获得的重组IGF-I蛋白大小为12.1 k D,37℃下用0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3 h时目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的39.8%,主要以包涵体形式存在。Western blotting免疫印迹表明星突江鲽IGF-I重组蛋白均可被6×His抗体特异性识别。包涵体经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性后,可获得高纯度的IGF-I重组蛋白。细胞增殖试验结果显示0.6μg/m L的星突江鲽IGF-I重组蛋白能显著促进人胚胎肾细胞HEK293T的增殖而大于1.8μg/m L时则表现出抑制作用。本研究成功构建了星突江鲽IGF-I体外高效表达系统,并获得具有细胞水平生物活性的星突江鲽IGF-I重组蛋白,结果可为深入探究IGF-I在星突江鲽生长发育中的作用机制及研制高效绿色的促生长制剂提供基础资料。
- 徐永江臧坤柳学周史宝陈圣毅
- 关键词：星突江鲽胰岛素样生长因子I原核表达生物活性
- 星突江鲽胰岛素样生长因子II的原核表达与生物活性分析被引量：1
- 2015年
- 根据鲽形目和鲈形目鱼类的IGF-II基因保守序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆得到编码星突江鲽(Platichthys stellatus)IGF-II成熟肽的全长c DNA序列(210 bp),同源性分析显示IGF-II成熟肽在B、A和D区高度保守。利用原核表达载体p ET-28a构建了重组表达质粒(IGF-II/p ET28a),转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导,获得了N端含6个组氨酸的重组蛋白。37℃条件下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的42.7%。重组蛋白主要以包涵体形式存在,经SDS-PAGE电泳检测,IGF-II重组蛋白大小为11.4 k D,Western-Blotting免疫印迹呈阳性。包涵体经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性后,获得了纯化IGF-II蛋白。细胞增殖实验结果显示,重组蛋白可显著促进人胚胎肾细胞HEK293T的增殖,表明获得的IGF-II重组蛋白具有细胞水平的生物活性。研究结果为深入研究星突江鲽IGF-II的功能提供了基础资料。
- 臧坤徐永江柳学周史宝王妍妍
- 关键词：星突江鲽IGF-II原核表达生物活性
- 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)IGF-Ⅱ的体外重组表达被引量：1
- 2015年
- 为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的生理功能,将IGF-Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体p ET-28a中,成功构建了重组半滑舌鳎IGF-Ⅱ/p ET28a质粒,导入到E.coli BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,获得了大小为11.4 k Da的重组IGF-Ⅱ蛋白,N端含6个组氨酸,可特异性地被6×His抗体识别。重组IGF-Ⅱ蛋白在最优诱导条件37℃诱导2 h,目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的43.7%,重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后,获得了纯化的IGF-Ⅱ重组蛋白,其可在体外显著促进人乳腺癌MDA231细胞的增殖,表明IGF-Ⅱ重组蛋白具有体外细胞水平的生物活性。本研究结果可为认识鱼类IGF-Ⅱ生理功能及半滑舌鳎生长调控机制提供理论支撑。
- 徐永江柳学周张凯武宁宁刘芝亮李春广
- 关键词：半滑舌鳎原核表达生物活性
- 星突江鲽生长激素基因的克隆及体外重组表达分析被引量：2
- 2014年
- 利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得星突江鲽生长激素基因(GH)的cDNA序列全长为957 bp,其中开放阅读框(ORF)长615 bp,编码204个氨基酸,氨基酸序列与牙鲆同源性最高达到73.0%,系统进化显示,星突江鲽GH与其他鲽形目和鲈形目鱼类聚为一个分支。采用实时荧光定量PCR技术对GH基因的组织表达特性进行了分析,结果显示,GH基因mRNA主要在雌雄成鱼垂体中表达,同时在脑、性腺、肝脏、胃和肌肉中均检测到表达,雌鱼胃和肌肉中GH基因mRNA的表达量显著高于雄鱼(P<0.05),表明星突江鲽GH可能主要通过旁分泌和自分泌方式参与性别二态性生长调节。本实验成功构建了体外重组表达质粒GH/pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导可得N端含6个组氨酸的重组蛋白。重组蛋白主要以大小为24.9 ku的包涵体形式存在,Western-blotting免疫印迹呈阳性。包涵体经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性后可得纯化GH蛋白;5.4和16.2μg/mL重组蛋白添加组中,人胚胎肾细胞HEK293T的增殖受到显著抑制。本研究结果可在分子和蛋白水平解析星突江鲽的生长调控机制。
- 臧坤柳学周徐永江张凯史宝史学营李存玉
- 关键词：星突江鲽生长激素基因克隆原核表达
- 半滑舌鳎类胰岛素生长因子-Ⅰ的原核表达及活性分析被引量：8
- 2013年
- 根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列,设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列,此序列由210个碱基组成,包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上,得到重组质粒,将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽,结果表明:IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD,IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的58.5%,1 L菌液表达目的蛋白40.7 mg,主要以包涵体形式存在。利用Western-blotting方法验证融合蛋白可特异性的被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性,获得大小为11.4 kD的纯化蛋白。细胞增殖实验表明,IGF-I融合蛋白可显著促进乳腺癌细胞MDA231细胞的增殖,具有生物学活性。本研究通过原核表达技术获得了体外重组的具有生物活性的半滑舌鳎IGF-I融合蛋白,结果可为半滑舌鳎生长调控技术研究提供基础资料。
- 刘芝亮徐永江柳学周史宝王妍妍
- 关键词：半滑舌鳎IGF-I原核表达生物活性
- 外源激素对二龄圆斑星鲽卵巢发育诱导效果的初步研究被引量：1
- 2013年
- 为了认识2龄雌性圆斑星鲽的生殖特性和生殖潜力,采用注射外源激素诱导方法,研究了外源激素鲑鱼促性腺激素释放激素(GnRH)、促黄体素释放激素类似物(LHRH)诱导2龄雌鱼卵巢发育的效果。结果表明:两种外源激素以GnRH对卵母细胞成熟的诱导效果为好,经外源激素诱导后,有约30%实验鱼的卵巢部位可见相对明显的隆起,组织切片观察显示,实验鱼卵母细胞可达到5时相早期,但未能发生水合作用而成熟,表明2龄圆斑星鲽对外源激素的诱导应答效应较弱;外源激素诱导后,血浆中性类固醇激素(雌二醇和睾酮)的表达水平显示显著升高,96h后表达水平下降恢复至正常水平;同时发现,激素诱导实验鱼的肝细胞直径增加,表明外源激素诱导可能部分启动了卵母细胞发育成熟所需卵黄蛋白物质的发生和转化过程。未能获得亲鱼产卵,可能是由于2龄人工亲鱼内分泌成熟调控系统对外源激素的响应机制未完全建立所导致。研究结果为认识人工养殖条件下圆斑星鲽的生殖特性及生殖潜力评价提供了理论支持和技术依据。
- 徐永江柳学周王妍妍
- 关键词：圆斑星鲽外源激素诱导卵巢发育
- 七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ成熟肽的克隆及原核表达与活性分析被引量：1
- 2013年
- 应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ融合蛋白能促使人乳腺癌细胞MDA231细胞增殖,表明具有生物活性。
- 陈圣毅刘新富徐永江刘芝亮柳学周史宝王妍妍
- 关键词：七带石斑鱼原核表达生物活性分析
- 鱼类促性腺激素抑制激素及其受体的研究进展被引量：3
- 2016年
- 促性腺激素抑制激素是2000年由日本学者首次从鹌鹑脑中分离出的一种新型下丘脑神经肽,通过其受体介导参与机体的生长、生殖以及摄食等生理过程。迄今,只在金鱼、斑马鱼、星点东方鲀、罗非鱼以及斜带石斑鱼等几种鱼中鉴定出促性腺激素抑制激素。目前,鱼类促性腺激素抑制激素的生理学功能研究相对较少,且存在争议。鱼类促性腺激素抑制激素及其受体的表达调控以及其他生理学功能仍有待进一步研究。本研究简要总结鱼类促性腺激素抑制激素及其受体的研究进展,并对促性腺激素抑制激素的生理学功能进行概括讨论,旨在加深对鱼类促性腺激素抑制激素的认识和了解,为进一步研究做铺垫。
- 王滨柳学周徐永江史宝
- 关键词：鱼类生殖
