国家自然科学基金(30871880)
- 作品数：5 被引量：18H指数：3
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- 绵羊肺炎支原体P30-HSP70C融合蛋白的表达及免疫原性研究被引量：5
- 2014年
- 为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30和r P30-HSP70C以100μg/只剂量分别免疫小鼠,免疫两次。间接ELISA试验表明,免疫的小鼠血清中两种蛋白的抗体效价分别为1∶8 000和1∶128 000。此外,两种蛋白免疫的小鼠血清中均检测出特异性的P30抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,r P30和r P30-HSP70C的免疫保护率分别为50%和80%。这些结果表明P30和HSP70C的融合表达可以显著增强P30蛋白的免疫保护效果。
- 刘文青胡明丽孙红岩赵宝华
- 关键词：绵羊肺炎支原体P30克隆免疫原性
- 绵羊肺炎支原体Y98 P30基因的克隆、表达及免疫试验被引量：8
- 2012年
- 根据猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)跨膜蛋白P30基因序列设计引物,通过PCR克隆出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)膜蛋白P30基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MOP30基因与Mhp P30基因核苷酸序列同源性为79%。抗原表位及跨膜结构预测的结果表明,MO P30基因与Mhp P30基因的抗原表位及跨膜结构均具有高度的一致性。该片段中含1个TGA编码Trp,而不是终止密码子。将P30基因与原核表达载体pET-28a连接构建pET-28a-P30表达质粒,转化受体菌Rossta得到重组菌株Rossta(pET-28a-P30)。经诱导后SDS-PAGE表明有30 000左右的目的条带出现;Western blot表明Rossta(pET-28a-P30)表达的30 000蛋白主要以包涵体的形式存在;小鼠免疫试验表明Rossta(pET-28a-P30)原核表达的蛋白对小鼠具有一定的保护作用。
- 赵红艳刘文青车腾飞卢金华宋静岚赵宝华
- 关键词：P30基因基因表达免疫动物
- 绵羊肺炎支原体Y98 P26-P40融合基因的表达及免疫原性被引量：2
- 2013年
- 根据猪肺炎支原体(Mycoplasma Hyopneumoniae,Mhp)外膜蛋白P30基因和P46基因序列设计引物,通过PCR克隆了绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)标准株Y98膜蛋白P26基因和P40基因片段。通过对该序列的同源性分析表明MO P26基因与Mhp P30基因核酸序列同源性为79%,MO P40基因与Mhp P46基因核酸序列同源性为74%。分别将MO P26基因、MO P40基因以及P26-P40融合基因与原核表达载体pET28a连接构建了表达质粒pET28a-P26,pET28a-P40,pET28a-P26-P40,并转化受体菌BL21(DE3)得到重组菌株BL21(DE3)(pET28a-P26),BL21(DE3)(pET28a-P40),BL21(DE3)(pET28a-P26-P40)。经IPTG诱导后SDS-PAGE表明有26 000,40 000和66 000左右的目的条带出现;Western blotting表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性;小鼠免疫试验表明重组菌株BL21(DE3)(pET28a-P26),BL21(DE3)(pET28a-P40),BL21(DE3)(pET28a-P26-P40)表达的蛋白对小鼠的保护率分别为90%,90%和100%;重组菌株BL21(DE3)(pET28a-P26-P40)表达的蛋白对绵羊的保护率为85%。本试验结果为研制绵羊肺炎支原体基因工程疫苗奠定了坚实的基础。
- 刘文青范琼瑛赵红艳车腾飞赵宝华
- 关键词：基因表达免疫原性
- 绵羊肺炎支原体标准株Y98外膜蛋白MOP30基因真核表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达被引量：3
- 2012年
- 以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneoniae,MO)标准株Y98基因组为模板,设计1对特异引物,PCR扩增得到798bp的P30目的基因(MOP30),将其定向克隆到pMD19-T Simple载体中进行测序分析。重组质粒进行XbaⅠ/BamHⅠ双酶切并回收目的片段,将目的基因亚克隆入黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)表达载体pCAMBIA1300-YFP中构建重组融合表达质粒pCAMBIA1300-MOP30-YFP。双酶切验证后的融合表达质粒转化农杆菌(Agrobacterium)感受态细胞,侵染烟草(tobacco)叶片。通过激光共聚焦成像显微镜(cofocal imagingmicroscope)观察到融合表达的黄色荧光蛋白,Western-blotting试验得到57 000的特异条带,RT-PCR检测到MOP30基因在烟草叶片中转录。MOP30-YFP融合蛋白在烟草中的成功表达,为转基因植物疫苗防治绵羊支原体肺炎奠定了基础。
- 张亚宁赵利峰张乐祎赵宝华
- 关键词：绵羊肺炎支原体黄色荧光蛋白真核表达
- 绵羊肺炎支原体Y98标准株P30外膜蛋白与IFN-γ的融合表达及其免疫原性被引量：3
- 2013年
- 以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneonia,MO)标准株Y98的P30外膜蛋白为抗原,同时以细胞因子IFN-γ为佐剂,将两者串联融合表达。小鼠免疫保护试验结果显示,P30重组蛋白的免疫保护率为60%,IFN-γ重组蛋白的免疫保护率为20%,P30-IFN-γ重组蛋白的免疫保护率达到80%。间接ELISA试验证实,经100μL与200μL P30-IFN-γ重组蛋白免疫小鼠的血清中,P30抗体效价分别为1∶32 000与1∶64 000。以上结果证实,所制备的重组蛋白对小鼠实验个体基本安全,且P30-IFN-γ重组蛋白中的细胞因子IFN-γ组分可以调节机体免疫机能,增强P30蛋白的免疫保护效果。
- 张亚宁刘文青赵红艳张乐祎赵宝华
- 关键词：绵羊肺炎支原体P30基因IFN-Γ
