四川省青年科技基金(200930421)
- 作品数：8 被引量：13H指数：2
- 相关作者：朱玲郭万柱徐志文梅淼廖珊更多>>
- 相关机构：四川农业大学重庆市畜牧科学院中江县畜牧局更多>>
- 发文基金：四川省青年科技基金长江学者和创新团队发展计划教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立被引量：1
- 2013年
- 扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。
- 刘骁廖珊朱玲周远成周璐
- 关键词：原核表达间接ELISA
- 乙型脑炎病毒NS3蛋白对其体外复制能力的影响被引量：4
- 2013年
- 为研究乙型脑炎病毒(JEV)NS3蛋白对其体外增殖能力的影响,为JEV疫苗的大量生产提供一定的理论基础,构建真核重组质粒pCI-neo-NS3并转染至BHK-21细胞内,接种JEV后于不同时间点采集细胞内以及细胞外病毒,采用荧光定量RT-PCR法检测各时间点细胞内和细胞外病毒含量,同时设立不同质量浓度NS3原核表达蛋白对JEV复制影响对照组。用SPSS 21.0统计分析软件分析,比较病毒增殖情况。分析结果显示转染含NS3基因的真核载体组细胞内和上清中病毒含量都极显著高于对照组(P<0.01),加入NS3原核表达蛋白组上清中病毒含量极显著低于对照组(P<0.01)。
- 廖珊刘骁朱玲徐志文郭万柱
- 关键词：乙型脑炎病毒NS3蛋白荧光定量
- ORF9基因缺失突变PCV2的构建与部分生物学特性被引量：2
- 2012年
- 设计1对针对猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组的特异性引物,从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后构建重组质粒pMD18-T Simple-PCV2(命名为P-S-PCV2)。用ORF9特异的限制性内切酶Bpu10Ⅰ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF9基因缺失突变的重组质粒(命名为P-S-PCV2-J)。用SacⅡ对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应缺失基因DNA(命名为PCV2-J)。用PCV2-J缺失突变株进行细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究。结果显示:PCV2-J转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长;PCV2-J接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV2-J突变病毒的感染;PCV2-J免疫仔猪后的抗体水平在第2周开始上升,与对照组相比差异显著,CD3+下降,与对照组无差异,CD4+下降,第1周与对照组差异显著,CD8+与对照组差异不显著。结果表明,ORF9基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,但免疫原性减弱。
- 曾秀梅淼郭万柱朱玲徐志文王印余庆
- 关键词：猪圆环病毒2型生物学特性
- PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性被引量：3
- 2012年
- 为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。
- 梅淼陈燕凌朱玲熊丁杰郭万柱王颖旺吴云飞徐志文
- 关键词：VP2基因ORF2基因B细胞表位
- 猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备
- 2013年
- 为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。
- 江一帆刘骁廖珊朱玲周远成
- 关键词：多克隆抗体
- ORF2基因缺失的PCV2的构建与部分生物学特性
- 2011年
- 设计了1对特异性引物,从疑似PMWS(断乳仔猪多系统衰竭综合征)的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2(命名为P-S-PCV2)。用ORF2特异的限制性内切酶EcoRⅠ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF2基因缺失突变的重组质粒(命名为P-S-PCV2-B)。用SacⅡ酶对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化的基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应的基因缺失病毒粒子(命名为PCV2-B)。用PCV2-B缺失突变株进行了细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究,结果显示,PCV2-B转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长。PCV2-B接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV-B突变病毒的感染。PCV2-B免疫仔猪后抗体没有升高;CD3+和CD4+整体水平下降,第2周与对照组差异显著;CD8+与对照组差异不显著。结果表明,ORF2基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,免疫原性减弱,细胞免疫被部分激活。
- 曾秀郭万柱朱玲徐志文王印梅淼余庆
- 关键词：猪圆环病毒2型重组质粒生物学特性
- PPV VP2基因与PCV2 ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性被引量：1
- 2011年
- 为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPV VP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPV SC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、C(A:117～131aa,B:157～183aa,C:165～200aa)和PPV VP2基因。将A、B、C基因分别与PPV VP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPV VP2蛋白和PCV2ORF2抗原表位的重组质粒pCI-A-VP2、pCI-B-VP2、pCI-C-VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4+/CD8+细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI-B-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。
- 徐志文郭万柱唐玉香朱玲陈燕凌徐凯梅淼
- 关键词：猪细小病毒真核表达
- 猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析被引量：2
- 2010年
- 本研究根据GenBank登录的猪圆环病毒基因组序列(DQ180392.1)来设计引物,用PCR法扩增出PCV-2四川株(PCV-2SC)ORF3基因,并克隆到PMD19-T载体进行测序,同时利用在线生物信息学软件及数据库对ORF3基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。研究结果表明,成功构建了命名为P-S-PCV-2SCORF3的重组质粒;测序结果得知PCV-2SCORF3基因全长315bp,共编码104个氨基酸;BLAST比对发现该基因与GenBank中国内外参考毒株核苷酸同源性在98%~100%之间。利用在线生物信息学软件对PCV-2SCORF3编码蛋白结构特征进行分析,发现该蛋白含有12个潜在的磷酸化位点,ORF3成熟蛋白有4个主要的抗原位点;亚细胞定位分析结果表明,编码蛋白主要存在于线粒体中和细胞核中并各占43.5%和34.8%,这证实了PCV-2SCORF3编码蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞核移动的趋势,功能强大,可能与细胞凋亡有关。疏水性分析发现,该编码蛋白具有一定的疏水性,与该蛋白的表面抗原决定族和膜蛋白中穿越膜的肽片段及该蛋白的高级结构的形成有关,预示其高疏水性区又与膜蛋白的跨膜区有...
- 华丽朱玲史小红梅淼陈晓秋
- 关键词：ORF3基因克隆生物信息学分析
