国家自然科学基金(39830360)
- 作品数：19 被引量：78H指数：5
- 相关作者：傅继梁厉建中王水良杨桦龚振明更多>>
- 相关机构：第二军医大学复旦大学中国科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 肝组织特异表达人核受体nr5a2转基因小鼠的构建(英文)
- 2005年
- 人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子(hB1F)系FtzF1(NR5A)亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1fcDNA置于小鼠白蛋白增强子/启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卵回输至假孕母鼠输卵管。产下仔鼠经PCR和Southernblotting鉴定,同时RTPCR和Westernblotting分析转基因的表达。阳性Founder鼠与正常C57鼠交配以建立转基因纯系小鼠,F1代以PCR法鉴定。结果共获得4只PCR鉴定转基因阳性Founder鼠,其中一只同时经Southernblotting鉴定为阳性。RTPCR和Westernblotting结果显示,外源基因在转基因小鼠的肝组织成功表达。遗传学分析表明,转基因已整合入小鼠基因组并可稳定遗传。
- 王水良杨桦谢幼华汪垣厉建中王龙王铸钢傅继梁
- 关键词：核受体转基因小鼠
- 小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与基因结构以及5′端启动子活性的分析被引量：3
- 2003年
- 人类锌指蛋白ZNF191为类kr櫣ｐｐｅｌ转录因子 ,其可能与神经精神病、心血管疾病和肝癌等疾病的发生或发展有关 ,为了采用基因敲除模型来探讨它的生理功能 ,克隆和定位其在模式生物 (小鼠 )中的同源基因 ,并阐明其结构特征是必需的。通过筛选小鼠λ噬菌体基因组文库 ,获得了它在小鼠中的同源基因ZF 12基因组全长片段。序列分析表明 :该基因含有 4个外显子和 3个内含子 ,内含子都遵循GT AG的剪接模式 ;第 91密码子处存在单核苷酸多态性 ;可能存在 2种大小不同的 3′端的非翻译区 (3′ UTR) ;与锌指蛋白基因Zfp 35相连锁 ,可将其定位于 18号染色体的B3 C带上或附近 ;5′端上游存在 1个约 2 5 0bp高度富含GC的启动子序列。ZF 12基因的 5′端系列缺失荧光素酶基因报告载体的瞬时转染实验表明 :其上游序列 (- 76 2～ +70bp)具有启动子转录活性 ,在更上游的序列(- 82 4～ - 76 2bp)上可能存在负调控元件。这项研究结果为进一步的基因敲除研究奠定了基础。
- 厉建中陈霞王水良孙霞张亚洲余龙傅继梁
- 关键词：基因结构启动子
- 小鼠胚胎干细胞p16^(INK4a)基因外显子1α打靶研究被引量：5
- 2002年
- 在活体水平上 ,小鼠p16 INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16 INK4a基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠p16 INK4a 基因外显子 1α的基因打靶载体 ,其短臂为1.5kbEco81Ⅰ AccⅡ片段 ,长臂为 5 .9kbXbaⅠ XhoⅠ片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1ES细胞 ,获得 37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定 ,获得一个敲除了p16 INK4a基因外显子 1α的阳性ES细胞克隆。
- 龚振明李坚傅继梁
- 关键词：P16^INK4A基因打靶胚胎干细胞
- 表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞系的建立及其特性研究
- 1999年
- 杨桦戴旭明傅继梁
- 关键词：胚胎干细胞系昆明种小鼠注射方式嵌合体发育规律
- 小鼠p35^(nck5a)基因5′侧翼非编码区基因表达调控作用研究
- 2001年
- 目的 探讨决定 Alzheimer's病 (AD)的相关基因 p35 nck5 a神经特异性表达的分子机理。方法通过构建荧光素酶表达载体 ,利用原代培养神经细胞进行瞬时表达实验寻找指导神经特异性表达的顺式作用元件 ,并通过引物延伸实验寻找转录起始位点 ,通过染色质 DNase1高敏位点 (DNase1hypersensitivesite,DHSS)实验确定与 p35 nck5 a转录相关的 DNase1高敏位点。结果 瞬时表达实验结果显示在神经细胞和非神经细胞中 ,所构建的各载体的表达情况没有明显差异 ;在新生大鼠的脑组织和肝组织中存在染色质DNase 1高敏位点的差异 ,该位点大约位于脑基因组 p35 nck5 a编码区上游 - 40 0 bp处。引物延伸实验结果显示主要的转录起始位点的位置与 DNase1高敏位点的位置具有一致性 ,与瞬时表达实验结果也具有相关性。结论 以上结果提示在所克隆到的 p35 nck5 a5′侧翼序列中不存在决定该基因组织特异性表达的顺式作用元件 。
- 朱海英周常文傅继梁
- 关键词：基因表达阿尔茨海默病
- p35^(Nck5a)基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究被引量：2
- 2000年
- 为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复，采用常规的分子克隆技术，构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆，细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定，２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复，同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。
- 周常文傅继梁薛红
- 关键词：基因打靶基因重复AD
- 小鼠p16^(INK4a)基因外显子1α胚胎干细胞条件打靶研究被引量：1
- 2002年
- 目的 研究打靶载体的结构与打靶效率的关系 ,探讨小鼠 p16 INK4 a基因在活体水平上抑制肿瘤发生和发展的功能。方法 利用筛选基因组文库得到的小鼠 p16 INK4 a基因组 DNA片段 ,设计并构建了针对小鼠 p16 INK4 a基因外显子 1α的条件打靶载体 ,其短臂为 2 .0 kb Eco R / Xba 片段 ,长臂为 5 .9kb Spe / Not 片段 ,上游交叉位点 (locus of crossing- over,lox P)位于外显子 1α起始密码上游 2 4 0 bp处 ,下游lox P位于外显子 1α起始密码下游 16 33bp处 ,经重组酶 (Cre)介导后可将外显子 1α和选择标记 Neo基因同时删除。结果 将此条件打靶载体通过电穿孔转导小鼠胚胎干细胞 ,获得 2 4个药物抗性克隆 ,其中 1个经 Southern杂交证实为正确同源重组克隆。结论 在同源臂两侧各用一个
- 龚振明郑敬民傅继梁
- 关键词：P16^INK4A基因胚胎干细胞打靶载体
- 锌指蛋白基因ZNF191被引量：11
- 2001年
- 厉建中李坚傅继梁
- 关键词：锌指蛋白基因ZNF191SCAN
- 小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立被引量：3
- 2002年
- 利用小鼠锌指蛋白ZF 12基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠ZF 12基因座的替换型打靶载体pSSC TV 10 .5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后 ,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES细胞内 ,经G4 18/GANC双药筛选和分子鉴定 ,获得 4个ZF 12 + /-基因的ES细胞杂合子克隆 ,其生长状态良好 ,为进一步建立ZF 12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。
- 厉建中杨桦傅继梁
- 关键词：小鼠锌指蛋白基因基因剔除ES细胞系基因打靶
- p16^(INK4a)基因的功能及其调控被引量：9
- 2002年
- p16 INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性 ,使 pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合 ,从而抑制DNA的合成 ,阻止细胞由G1期进入S期 .p16 INK 4a的表达受Ets1和Ets2的正调控 ,受Bmi 1的负调控 .p16 INK 4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变 .应用p16 INK 4a 对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中 .
- 龚振明傅继梁
- 关键词：P16^INK4A基因调控肿瘤发生
