国家自然科学基金(81271867)
- 作品数：10 被引量：17H指数：2
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- 相关机构：中国疾病预防控制中心复旦大学宁夏疾病预防控制中心更多>>
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- 日本血吸虫表皮生长因子受体基因的鉴定和功能研究
- 2020年
- 目的鉴定日本血吸虫表皮生长因子受体基因(SjEGFR),并阐明其在日本血吸虫生长和生殖发育中的作用。方法通过5’-RACE和3’-RACE扩增、测序获取SjEGFR基因全长片段。采用荧光定量PCR(qPCR)技术检测该基因在日本血吸虫不同发育阶段(16、18、20、22、24、26 d)表达情况。使用整条虫体原位杂交法对感染24 d的日本血吸虫雌、雄虫SjEGFR基因转录本进行定位。通过体内持续RNA干扰(RNAi)技术特异性敲低SjEGFR基因,待虫体发育至30 d收集虫体。统计分析雌、雄虫回收数量以及虫体长度,通过明矾卡红染色观察虫体生长发育情况。结果首次鉴定了SjEGFR基因,其结构具有一个保守的酪氨酸激酶位点。整条虫体原位杂交定位显示该基因转录本在虫体各处均有表达,在雌、雄虫肠道部位呈现出明显着色的高表达。体内RNAi显示,SjEGFR基因表达被特异性敲低后,雌、雄虫生长受阻。RNAi组雌虫子宫内无虫卵,肠道内无色素沉积、卵黄腺发育迟滞、卵巢发育受阻;雄虫呈现睾丸个数减少、体积变小,出现了更多未成熟的精母细胞。结论特异性敲低SjEGFR基因表达可影响日本血吸虫生长和生殖发育,阻滞虫卵产生。
- 相慢玉李健罗芳孙成松朱炳宽王吉鹏莫筱瑾张颋徐斌冯正胡薇
- 关键词：日本血吸虫表皮生长因子受体生殖
- 血吸虫尾蚴侵染分子机制研究进展被引量：2
- 2013年
- 尾蚴穿透宿主皮肤是血吸虫成功感染终宿主的第一步。尾蚴钻腺分泌的蛋白酶在穿透宿主皮肤过程中发挥了重要作用。目前对于血吸虫感染分子机制的研究主要集中在包括丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶在内的尾蚴分泌蛋白酶上。已有研究表明,曼氏血吸虫主要靠尾蚴分泌的弹性蛋白酶穿透宿主皮肤,日本血吸虫则主要利用组织蛋白酶B2侵入宿主体内。尾蚴入侵分子机制的阐明有助于新型血吸虫病疫苗的研制和药物靶点的发现。
- 杜晓峰鞠川胡薇
- 关键词：血吸虫尾蚴蛋白酶
- 日本血吸虫钙蛋白酶基因的原核表达及功能分析被引量：1
- 2014年
- 目的克隆表达日本血吸虫钙蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴内的分布及其在尾蚴侵染中的作用。方法根据SjCalpain基因全序列(GenBank登录号为AB016726)设计引物,PCR分别扩增Sjcalpain的催化位点区域和Ca2+结合位点区域的基因片段,克隆入pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中进行原核表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达和纯化情况。纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体,ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测多克隆抗体的效价和特异性。利用免疫荧光定位技术观察Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况。将尾蚴和钙蛋白酶抑制剂孵育后感染小鼠,计算血吸虫减虫率。结果成功构建了Sjcalpain的催化位点/pET-28a和Ca2+结合位点/pET-28a原核表达重组质粒,在E.coli BL21(DE3)中成功表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为43 000和39 000,与预期大小一致,且均为包涵体表达。组氨酸标签亲和层析成功纯化得到目的重组蛋白。间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价超过1∶80 000。免疫定位结果显示,Sjcalpain在日本血吸虫尾蚴头部分布较多。尾蚴侵染抑制实验中,钙蛋白酶抑制剂作用组平均获虫19条,对照组平均获虫23条,减虫率为17.4%。结论 Sjcalpain蛋白产物主要分布在日本血吸虫尾蚴的头部;Sjcalpain被抑制后可以减少入侵宿主的尾蚴数量,说明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮肤过程中发挥一定的作用。
- 杜晓峰徐斌刘建王吉鹏刘牧刘秀凤马晓琳胡薇鞠川
- 关键词：日本血吸虫尾蚴钙蛋白酶免疫定位侵染
- 宁夏2016-2017年土源性线虫感染监测被引量：5
- 2019年
- 为了解宁夏土源性线虫感染现状, 2016-2017年在贺兰县、海原县及平罗县等3个监测点,每个监测点按地理方位划分为东、西、南、北、中5个片区,每个片区抽取1个乡镇的1个行政村开展监测,每个行政村整群抽取3周岁以上常住居民200人。收集调查对象粪样,采用改良加藤厚涂片法(一粪二检)查土源性线虫虫卵,采用问卷调查收集调查对象信息。结果显示, 2016-2017年,总感染率为1.4%(83/6 047),其中海原县的感染率(2.2%, 45/2 059)高于其他县区(P <0.05)。女性感染率为1.6%(50/3 099),男性感染率为1.1%(33/2 948),差异无统计学意义(P> 0.05)。≥60岁和40~59岁人群感染率较高,分别为1.7%(26/1 519)和1.8%(33/1 852),各年龄组间差异有统计学意义(P <0.05)。农民感染率最高,为1.6%(71/4 528),各职业组间差异无统计学意义(P> 0.05)。高中及以上文化程度感染率最高,为1.6%(17/1 034),不同文化程度组间差异无统计学意义(P> 0.05)。宁夏土源性线虫感染呈下降趋势,需采取分类指导措施,降低感染水平。
- 段红菊马荣付益仁吴向林马天波齐蓉婷
- 关键词：土源性线虫病
- 慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫体内的表达和检测被引量：2
- 2016年
- 目的验证外源绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫(Schistosoma japonicum)体内能否成功表达并产生绿色荧光。方法采用荧光显微镜观察日本血吸虫不同虫期虫体的背景荧光情况。利用含有由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的绿色荧光蛋白zs Green基因的慢病毒载体感染体外培养的14 d童虫,未感染对照组采用不含慢病毒的RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)培养。感染后48 h,提取童虫基因组DNA和总RNA,合成c DNA,PCR检测zs Green基因是否整合入基因组以及绿色荧光蛋白m RNA的转录表达情况。在感染后24和48 h,以及换为不含慢病毒的RPMI 1640培养液后的不同时间点,使用荧光显微镜观察被感染童虫发出的绿色荧光,并判断其是否为绿色荧光蛋白基因在虫体内表达而产生的绿色荧光信号。结果荧光显微镜观察可见,日本血吸虫童虫无明显自发荧光现象,成虫可自发明显荧光。感染组童虫基因组DNA和总c DNA PCR检测结果显示,均扩增出大小为173 bp的阳性条带,与zs Green基因片段一致,且测序结果正确。荧光显微镜观察可见,而感染组童虫在感染后24 h,肠道内出现绿色荧光亮点,但疑似食物残渣。感染后48 h,童虫肠道发出均匀的绿色荧光,其亮度高于慢病毒培养液的背景荧光亮度。更换为不含慢病毒的RPMI 1640培养液3 d后,童虫肠道内绿色荧光变弱,一周后绿色荧光消失。重新更换为含慢病毒的RPMI 1640培养液感染童虫,2 d后在肠道内再次发现均匀绿色荧光。未感染对照组童虫未出现绿色荧光。结论外源绿色荧光蛋白可在日本血吸虫体内表达,但荧光显微镜下观察到的绿色荧光信号还有待进一步确认。
- 辛玥赵楠李青胡薇
- 关键词：日本血吸虫绿色荧光蛋白慢病毒载体
- 慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫体内的成功表达
- 2017年
- 目的了解日本血吸虫(Schistosoma japonicum)体内能否表达外源绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),并产生绿色荧光。方法构建p EGFP-Lac Z-C1融合蛋白表达质粒,以聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)为转染试剂,分别转染哺乳动物293T细胞和感染小鼠后14 d的日本血吸虫童虫,未转染阴性对照组不做任何处理;转染后48 h,在荧光显微镜下观察被转染的293T细胞和日本血吸虫童虫是否有GFP绿色荧光产生;对被转染的293T细胞和日本血吸虫童虫进行β-半乳糖苷酶原位染色,在光学显微镜下观察是否有蓝色产物产生。同时,将日本血吸虫童虫放入培养293T细胞的12孔板中,分别在光学显微镜和荧光显微镜下观察。用未稀释的、滴度为3×10~8菌落形成单位(CFU)/ml的慢病毒体外感染日本血吸虫童虫和293T细胞96 h后,在荧光显微镜下观察是否有GFP绿色荧光产生。结果p EGFP-Lac Z-C1转染293T细胞后,可以观察到GFP绿色荧光,β-半乳糖苷酶原位染色后也可以观察到蓝色的斑点,而在对照组和日本血吸虫童虫中,均未观察到GFP荧光和蓝色斑点。日本血吸虫童虫和293T细胞GFP荧光的比较发现,293T细胞发出的GFP荧光亮度明显高于日本血吸虫童虫的自发荧光,且293T细胞GFP荧光为艳绿色,而日本血吸虫童虫的自发荧光为黄绿色。在慢病毒感染实验中,未稀释的慢病毒感染96 h后,在荧光显微镜下可以清晰地看到血吸虫肠道外围组织中有许多艳绿色的荧光亮点,日本血吸虫童虫GFP的颜色及亮度与293T细胞中的基本一致,且荧光亮点的移动与虫体的肌肉运动基本保持一致。结论日本血吸虫童虫的背景荧光在外源GFP表达充足的情况下并不会影响荧光的观察。未稀释的慢病毒感染日本血吸虫童虫96 h后可提高转染效率,增加GFP表达量,在体内观察到GFP的绿色荧光。
- 赵楠李青胡薇
- 关键词：日本血吸虫绿色荧光蛋白慢病毒载体
- 日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究被引量：2
- 2015年
- 目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P<0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。
- 柴日奕王吉鹏李健张瑞祥李青刘牧辛玥徐斌胡薇
- 关键词：日本血吸虫原位杂交免疫保护
- 血吸虫转录因子研究现状
- 2016年
- 血吸虫病是一种危害严重的全球性人兽共患寄生虫病。新药和疫苗开发是血吸虫病防治工作中的一项重要环节。了解血吸虫转录调控机制及转录因子具体功能将有助于理解血吸虫生长发育的分子机制,为筛选新药和疫苗作用靶点提供参考。本文主要就血吸虫转录因子研究现状及研究方法进行综述。
- 辛玥刘牧李青胡薇
- 关键词：血吸虫转录因子转录调控
- 日本血吸虫醛糖还原酶基因RNA干扰效应的初步研究被引量：4
- 2014年
- 目的研究siRNA诱导的日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)基因转录本和蛋白水平的RNA干扰(RNAi)效应。方法设计并合成2条针对SjAR基因的siRNA(siRNA-1和siRNA-2)和1条阴性对照siRNA(siRNA-NC)。用日本血吸虫尾蚴感染4~6周龄雌性昆明鼠(800~1 000条/鼠),13 d后灌注小鼠肝门静脉收集童虫,每(120±10)条童虫为一组,分别采用电转法和浸泡法对各组童虫进行RNAi处理。电转处理法:向电击杯中分别加入5μg siRNA-1、siRNA-2、siRNA-NC或等体积的焦碳酸二乙酯(DEPC)水(空白对照),经125 V 20 ms方波脉冲电击童虫1次后,继续培养48 h;浸泡处理法:向童虫培养基中加入siRNA-1、siRNA-2或siRNA-NC溶液至siRNA浓度为200 nmol/L,第3天时更换一半新鲜培养基并补充siRNA,共培养5 d。每处理设3个平行对照组。干扰结束后,采用TRIzol法提取虫体RNA和可溶性总蛋白,将RNA反转录为cDNA,以SjGAPDH基因为内参,实时定量PCR检测SjAR转录本相对表达水平的变化,Western blotting分析SjAR蛋白水平的变化。结果实时定量PCR结果显示,采用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC电转后,虫体SjAR转录本水平分别为(90.6±16.2)%、(84.2±7.3)%和(105.9±10.3)%,与空白对照组[(100.9±16.8)%]的差异均无统计学意义(P>0.05);使用siRNA-1、siRNA-2浸泡后,SjAR转录本水平为(48.6±8.2)%和(73.4±4.7)%,均较空白对照组[(100.0±3.3%)]显著下降(P<0.01),而阴性对照siRNA-NC浸泡后的虫体SjAR转录本的表达水平为(101.43±14.33)%,与空白对照组比较表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting分析和条带定量结果显示,以空白对照组为标准,使用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC浸泡后,SjAR蛋白水平分别为79.0%、97.8%和103.2%。结论使用浸泡法对日本血吸虫童虫SjAR进行RNAi处理可降低靶基因转录本和蛋白的表达水平。
- 王树奇徐斌刘建王吉鹏胡薇
- 关键词：日本血吸虫醛糖还原酶RNA干扰
- 杭州市首例境外输入性罗阿丝虫病病例报告被引量：1
- 2020年
- 患者,女,25岁,学生,赤道几内亚人。患者于2019年8月23日左右开始出现左眼疼痛,8月24日左眼疼痛加剧,发现左眼上睑皮下有一寄生虫样蠕动(图1A),8月25日前往临安区人民医院急诊科就诊,当时眼睑处寄生虫样蠕动消失,经检查(眼科会诊),眼睑、眼结膜、眼内均未见任何异常情况,建议及时复查。8月26日再次前往临安区人民医院门诊眼科就诊,检查发现左眼球结膜有寄生虫样蠕动(图1B),建议入院手术治疗,当天入住临安区人民医院眼科。查体:体温36.7℃,正常面容,右眼(裸)4.0,(矫)4.4,左眼(裸)4.0,(矫)4.3,双眼睑未见明显寄生虫样蠕动,右眼球结膜未见明显寄生虫样蠕动,左眼颞侧球结膜下可见一寄生虫样蠕动物,双眼角膜透明。
- 叶亚君阮卫王笑笑赵明周贤波张家祺姚立农
- 关键词：眼球结膜双眼睑眼科会诊病例报告眼结膜
