卫生部临床学科重点项目(3030902005)
- 作品数：4 被引量：31H指数：3
- 相关作者：葛坚魏雁涛刘炳乾凌运兰高前应更多>>
- 相关机构：中山大学中山大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：卫生部临床学科重点项目国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Pro370Leu突变型myocilin抑制人小梁网单层细胞渗透性
- 目的：研究 myocilin 基因 Pro370Leu 突变对体外培养人小梁网细胞单层渗透性的影响。方法：构建 pIRES2-EGFP 野生型和 Pro370Leu 突变型 myocilin 真核表达载体,用 G418 ...
- 张跃红葛坚何媛段山江儒章段永恒孙雪荣
- 文献传递
- 单纯疱疹病毒胸腺激酶基因系统抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的研究被引量：3
- 2006年
- 目的研究单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-tk)基因系统对人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTFs)增殖的抑制作用及其作用机制。方法构建含HSV-tk基因的逆转录病毒载体pL(tk)SN并转入包装细胞系PT67进行病毒包装,G418筛选抗性克隆并扩大培养收集病毒上清,测定病毒滴度。透射电镜观察鉴定病毒颗粒;聚合酶链反应(PCR)技术鉴定tk基因在病毒基因组中的整合。用病毒感染HTFs细胞,G418筛选并扩大培养,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫印迹法检测tk基因的表达;加不同浓度前药更昔洛韦(GCV)后,以MTT法检测tk基因对HTFs细胞增殖的抑制作用;采用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测凋亡细胞;电镜观察细胞形态学改变。结果酶切鉴定结果显示成功构建了逆转录病毒载体pL(tk)SN,电镜下包装细胞产生的病毒颗粒呈椭圆形,直径约100nm;病毒基因组中,PCR扩增出了tk基因;测得病毒滴度为4×107cfu/ml;被转染的HTFs细胞,用RT-PCR及免疫印迹法检测到tk基因在mRNA与蛋白水平均有表达;HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞增殖的抑制作用表现为剂量依赖性,5×10-3g/L的GCV作用5d可将细胞全部杀死,IC50为6×10-4g/L,HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞的杀伤机制表现为坏死与凋亡,凋亡率随GCV浓度的升高而增加。结论HSV-tk基因系统能有效抑制人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖,作用机制表现为细胞的坏死与凋亡。(中华眼科杂志,2006,42:212-217)
- 王继兵葛坚刘炳乾黄冰魏雁涛
- 关键词：单纯疱疹病毒属胸苷激酶更昔洛韦成纤维细胞
- 广州开角型青光眼家系致病基因定位与功能初步研究被引量：15
- 2005年
- 目的鉴定常染色体显性遗传家族性开角型青光眼家系(GZ.1)致病基因并探讨其致病机制。方法应用全基因组扫描、连锁分析、核苷酸直接测序法筛查GZ.1家系的致病性基因突变,进一步利用体外基因转染技术,观察突变型基因在小梁细胞中的表达、分布及对细胞凋亡的作用。结果GZ.1家系所有患者均存在myocilin基因第三外显子Pro370Leu杂合突变(16/16),而家系正常人中均未检测到该突变(0/8)。小梁细胞体外转染野生型和突变型myocilin基因后,经免疫印迹法检测证实,培养上清液中突变型myocilin蛋白的细胞外分泌较野生型明显减少;荧光免疫组化检测结果证实野生型myocilin蛋白在小梁细胞内呈点状、弥漫分布;而Pro370Leu突变型myocilin蛋白以积聚体形式存在于胞质内;经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较野生型转染组及对照组轻度升高。结论突变型(Pro370Leu)myocilin基因为GZ.1家系的致病基因,突变型(Pro370Leu)myocilin蛋白在小梁细胞内以积聚体形式存在,可能是由于蛋白质错误折叠所致,并可能诱导小梁细胞凋亡。
- 魏雁涛段山葛坚卓业鸿凌运兰林明楷高前应
- 关键词：青光眼开角型细胞支架蛋白质类糖蛋白类
- POAG患者与正常人小梁网细胞ATP、ROS的对比研究
- 目的：研究 POAG 患者与正常人小梁网细胞内 ATP 与 ROS 的差异。方法：组织块培养法培养原代正常人与 POAG 患者小梁细胞;应用流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜检测小梁细胞内 ROS 水平、线粒体膜电位变化情况...
- 何媛葛坚张跃红段山钟秀凤江儒章段永恒彭展
- 文献传递
- RNA干扰技术抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的初步研究被引量：14
- 2005年
- 目的探讨RNA干扰技术对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的抑制作用。方法采用化学合成的靶向IKKβ的siRNA,转染体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞,同时以对任何基因均无作用的siRNA作为阴性对照。以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测IKKβmRNA表达水平,免疫印迹法检测IKKβ蛋白表达水平。将siRNA的转染浓度分别设为5、10、25、50、100、200nmol/L,进行转染,于转染后48h采用四甲基偶氮唑盐法检测其转染后对成纤维细胞的抑制作用。结果经转染了靶向IKKβ的siRNA,其成纤维细胞IKKβ的mRNA和蛋白表达水平均受到抑制。各个转染浓度(5、10、25、50、100、200nmol/L)均可抑制成纤维细胞的增殖(P<0.05),抑制率分别为10.72%、23.35%、30.84%、51.25%、50.06%、49.63%,50nmol/L时已达最大抑制率。结论靶向IKKβ的siRNA转染可以降低IKKβ的表达水平,同时对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖具有抑制作用。抗IKKβ的RNA干扰技术可能是抑制抗青光眼术后滤过道瘢痕化的新手段。
- 黄圣松葛坚王莉娜尹心宝魏雁涛马萍
- 关键词：RNA干扰蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶筋膜成纤维细胞细胞分裂
- 突变型Myocilin真核表达载体的构建及体外表达
- 2006年
- 目的:构建P370L突变型Myocilin真核表达载体及体外转染体系,为Myocilin功能研究提供实验基础。方法:应用定点诱变技术进行Myocilin基因第1131位氨基酸残基位点的定点突变,利用阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人小梁细胞,RT-PCR和WesternBlot检测Myocilin表达.结果:经克隆、测序证实获得突变基因,突变载体转染后人小梁细胞MyocilinmRNA和Myocilin蛋白质表达显著增加。结论:P370L突变型Myocilin真核表达载体成功构建,阳离子脂质体是人小梁细胞有效的体外转染体系。
- 王莉娜葛坚刘炳乾宋革侯飞
- 关键词：定点突变转染MYOCILIN
