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国家自然科学基金(30271017): 作品数：16 被引量：74H指数：5; 相关作者：施志仪张俊玲陈晓武顾一峰孙文慧更多>>; 相关机构：上海水产大学上海海洋大学南宁富莱欣生物科技有限公司更多>>; 发文基金：国家自然科学基金博士科研启动基金上海市教育委员会重点学科基金更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异被引量：4: 2005年; 为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状腺激素T4处理组中TRαA表达降低,而在硫脲处理组中TRαA表达反而增高。甲状腺激素T4对变态期牙鲆TRαA基因转录可能有下降调节作用。; 施志仪刘华; 关键词：牙鲆变态甲状腺激素受体

牙鲆碱性磷酸酶cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测被引量：8: 2007年; 为研究碱性磷酸酶(EC3.1.3.1;alkaline phosphatase,ALP)在牙鲆(Paralichthys Olivaceus)发育和变态中的作用,采用RACE的方法克隆了牙鲆ALP基因cDNA全长,通过生物信息学分析了核苷酸序列并进行蛋白结构预测.结果表明,牙鲆ALPcDNA全长为1811bp,能编码476个氨基酸的蛋白质,分子量为52293.1,等电点为7.67.编码区核苷酸GC含量在ALP同源基因中差异比较大,脊椎动物明显高于非脊椎动物和细菌.分子系统分析显示,牙鲆ALP和青黑斑河豚(Tetraodonnigroviridis)、斑马鱼(Danio rerio)的组织非特异性ALP有较高的同源性,分子进化树和物种进化树是一致的.在蛋白序列中的一些重要的功能位点,包括金属离子结合位点、N糖基化位点和丝氨酸磷酸化位点等表现了较高的保守性.牙鲆ALP和人胎盘ALP(PALP)在蛋白序列上有43%的相似性,其3D结构非常接近.通过氨基酸空间位置比较发现,牙鲆ALP中141和203位半胱氨酸对应于人PALP的121和183位半胱氨酸,推测能形成一个二硫键.在两者酶活性中心,3个金属离子结合的氨基酸残基非常保守,Zn离子周围的9个氨基酸中有2个不同;Mg离子周围的7个氨基酸也只有2个不同,包括一对类似的丝氨酸155和苏氨酸175.; 陈晓武施志仪; 关键词：牙鲆碱性磷酸酶蛋白质结构预测生物信息学

牙鲆kiss2基因的分子鉴定及表达分析: 2016年; 为克隆与牙鲆生殖相关的神经内分泌因子kiss2基因,并检测该基因在牙鲆成体不同组织及早期不同发育阶段的表达变化,本研究采用Trizol法提取牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段样品总RNA;参照其他物种的kiss2 c DNA序列,设计并合成kiss2引物进行PCR扩增;运用实时荧光定量PCR检测kiss2基因在牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段的表达情况。结果成功地获得长度为449 bp的牙鲆kiss2 c DNA序列,其中编码区序列为366 bp,编码121个氨基酸。在该序列中发现了高度保守的"FNYNPLTLRF"序列,此序列可以调节促性腺激素释放激素和黄体生成素的合成与释放。定量PCR结果显示,牙鲆kiss2基因在脑组织中的表达量最高,在卵巢和精巢中也均有表达;牙鲆kiss2基因在胚胎阶段表达量相对较低,而在孵化后第7 d其表达量显著增高,且在孵化后的第29 d达到高峰。说明牙鲆kiss2基因具有明显的时期和组织差异性表达,其在牙鲆脑中的丰富表达及在精巢和卵巢中的表达表明该基因可能在牙鲆神经系统与生殖中发挥重要作用。; 于善坤张俊玲施志仪付元帅张红梅; 关键词：牙鲆发育表达

牙鲆dazl基因的克隆与表达分析被引量：2: 2016年; dazl(deleted in azoospermia-like)基因是多种物种精子发生的重要调控因子,为探讨该基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺发育分化中的作用,本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析了其序列结构,并利用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现:牙鲆dazl cDNA序列全长2 031 bp,包括105 bp的5'端非翻译区,1 275 bp的3'端非翻译区和编码217个氨基酸残基的651 bp开放阅读框;氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的RRM(RNA recognition motif)结构域,且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性;荧光定量PCR结果显示dazl基因主要在牙鲆性腺中表达,且在精巢中的表达高于卵巢;在牙鲆早期发育阶段,dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有较高的转录本,而在原肠胚期表达开始降低,至孵化后3 d一直保持较低的水平,这些丰富表达的母源性dazl mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。本研究为进一步阐明dazl基因在牙鲆生殖发育中的功能奠定了基础。; 孙近近张俊玲孙文慧施志仪; 关键词：牙鲆 DAZL CDNA克隆基因表达

应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定被引量：3: 2015年; 以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2,emx2)为例,构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体,以期应用于mi RNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总RNA,参照已克隆出来的emx2基因c DNA序列,设计并合成emx2 3'UTR片段的引物并进行PCR扩增,将得到的基因片段和psi CHECK-2载体双酶切后,用T4 DNA Ligase酶进行连接反应,并转化入DH5α感受态细胞,筛选后得到野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区,并将emx2 3'UTR区的mi RNA靶点序列GACTTGA突变为AGTCCAG,成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的mi RNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于mi RNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体psi CHECK-emx2-3'UTR和psi CHECK-mutated-emx2-3'UTR。; 印翠张俊玲施志仪孙文慧孙近近; 关键词：牙鲆 MIRNA 定点诱变

牙鲆甲状腺激素受体TRαA蛋白的特征分析: 2012年; 属于核受体超家族成员的甲状腺激素受体TRαA在牙鲆骨骼肌和消化管上皮细胞中强烈表达,调节其组织特异性发育,在牙鲆变态中对其形态结构和生理功能变化起着重要的作用。为了预测TRαA蛋白的抗原表位、二级结构及三维结构,分析该基因的结构特征。我们以TRαA蛋白序列为基础,采用Garni-er-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schuhz方法预测TRαA蛋白质的二级结构;用Kyte-Dooht-tle方案预测蛋白质的亲水性;用Emini方案预测蛋白质的表面可能性;用Jameson-Wolf方案预测氨基酸的抗原性指数,利用PROSITE数据库在线网络服务器与SMART服务器、结合Cn3D软件分析牙鲆TRαA蛋白三维结构,为实验方法探索TRαA蛋白的抗原表位和制备多克隆抗体提供理论依据。; 王劲松刘华施志仪; 关键词：牙鲆基因结构分析

牙鲆Ⅰ型甲腺原氨酸脱碘酶基因片段的克隆及序列分析: 2006年; 在GenBank中查找到已知的斑马鱼、奥尼罗非鱼、金头鲷、爪蟾等物种的Ⅰ型甲腺原氨酸脱碘酶的基因序列并运用Primer Premier 5.0软件对这些物种的Ⅰ型甲腺原氨酸脱碘酶基因序列进行同源性分析。依据同源性较大的保守区基因序列设计一对引物,并提取变态期牙鲆仔鱼总RNA作为模板进行RT-PCR,得到一条cDNA片段。将产物连接到T载体中,转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将DNA测序所得到的基因序列翻译成蛋白序列和已知的奥尼罗非鱼、金头鲷、底鳉、斑马鱼的Ⅰ型甲腺原氨酸脱碘酶基因序列进行同源性分析。结果显示,利用RT-PCR的方法扩增出一条280 bp的目的基因片段,比对结果发现其和奥尼罗非鱼、金头鲷、底鳉、斑马鱼的Ⅰ型甲腺原氨酸脱碘酶基因的蛋白序列的同源性分别为85%,83%,81%,71%。对蛋白序列进行生物信息学分析发现整个蛋白序列中无信号肽,无糖基化位点,无跨膜结构域,但含有一个典型的T4_deiodinase结构。在N-端第69～70区段有β-折叠中心;第35～37区段可能形成转角或无规则卷曲;第8～13区段,第16～20区段等区段是柔性区域。D1蛋白N端第8～11区段,第47～55区段,第90～91区段为优势抗原表位区域。本实验所获得的基因序列是前尚未见报道的牙鲆Ⅰ型甲腺原氨酸脱碘酶基因序列的一部分,为进一步研究该基因的结构与生物学功能奠定了基础。; 刘华施志仪; 关键词：牙鲆克隆

牙鲆发育中ALP基因表达图式及功能分析被引量：7: 2007年; 为探讨研究碱性磷酸酶(ALP)在牙鲆发育变态中的表达与功能,采用组织学和分子生物学的方法对牙鲆ALP进行了研究。结果如下:1.组织化学染色显示原肠期胚体中即可以检测到ALP的活性。出膜后,在头和背部的活性比较强,而身体的内脏区域,活性较低,卵黄中没有表现出酶活性。仔鱼进食后,ALP开始在消化道中大量的表达,特别是在胃肠道粘膜层。2.牙鲆ALP cDNA全长为1 811 bp,预测能编码476个氨基酸的蛋白质。采用RT-PCR的方法在牙鲆卵到出膜后5天的时候不能检测到ALP基因表达,到变态前的仔鱼体内开始表达。在成鱼胃、肝、鳃、皮肤、皮下肌肉、肾中均能检测到ALP的表达。3.变态前的仔鱼身体总ALP活力约为出膜时的卵中酶活力的4倍,在变态期酶活力变化不大,但是在变态后期上升明显。甲状腺素(T4)在变态中对酶活力增加有明显的促进作用。作为甲状腺素合成抑制剂,硫脲(TU)能降低仔鱼体内酶活性。4.使用ALP的活性抑制剂左旋咪唑(TRM)处理的仔鱼消化功能和头部骨骼的发育受到一定的影响。消化道内食物很少,消化道上皮层中ALP免疫显色反应减弱。头部骨骼中发现较多骨细胞死亡而只留下一些细胞碎片,超过95%的仔鱼不能完成右眼的移位就发生死亡,变态比对照组迟缓。5.定量PCR结果表明,变态中期ALP基因表达量只有初期的1/2,变态后期却明显上升到变态初期的2.5倍,T4和TU处理对ALP基因表达产生影响的在中期和后期表现明显。中期T4组明显高于对照组和TU组,变态后期T4组和TU组均低于对照组。; 陈晓武施志仪顾一峰; 关键词：牙鲆碱性磷酸酶甲状腺素

牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用被引量：1: 2009年; 为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达载体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后,重组蛋白TRαA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dotblotting检测抗体效价达1:200000,检测证明抗体特异性良好。此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合,表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。; 贾亮施志仪张俊玲; 关键词：牙鲆原核表达抗体制备染色质免疫沉淀

碱性磷酸酶在大菱鲆不同组织的表达及其与甲状腺激素的关系被引量：9: 2011年; 为了探讨碱性磷酸酶(ALP)基因在大菱鲆(Scophthatmus maximus)体内的表达情况及在细胞水平上三碘甲状腺原氨酸(T3)对碱性磷酸酶(ALP)基因表达量的影响,利用荧光定量PCR法检测了大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织中ALP mRNA的表达情况,并且用0 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 5个不同浓度的T3处理大菱鲆肾细胞(SMKC),采用实时荧光定量PCR法测定T3处理后细胞中ALP mRNA的表达情况。结果表明,ALP mRNA在大菱鲆不同组织中的表达量各不相同,具有组织特异性。心脏组织中ALP mRNA的表达量最高,其次是肝脏组织中和鳃组织中,肌肉组织中ALP mRNA的表达量最少。不同浓度T3处理后大菱鲆肾细胞后,细胞中碱性磷酸酶基因的表达量存在明显的差异,ALP mRNA的表达量随着T3浓度的增加有递增趋势。结论认为,ALP基因在大菱鲆成鱼8个不同组织中均有表达,但其表达量却有明显的差异,具有组织特异性。ALP基因的表达量受甲状腺激素T3正向调控,并有浓度依赖性。; 田娟施志仪; 关键词：大菱鲆

国家自然科学基金(30271017)

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