江苏省科技支撑计划项目(BE2009629)
- 作品数：10 被引量：19H指数：4
- 相关作者：许正宏窦文芳史劲松许泓瑜张旦旦更多>>
- 相关机构：江南大学教育部更多>>
- 发文基金：江苏省科技支撑计划项目国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程医药卫生更多>>
- 基于胞内cAMP浓度测定融合蛋白GGH活性的改良方法被引量：4
- 2013年
- 目的:改良一种基于胞内cAMP浓度变化,用于融合蛋白GGH生物学活性测定的方法。方法:根据融合蛋白GGH是GLP-1类似物,能促进胰岛β细胞增殖,产生胞内第二信使cAMP的原理,利用酶联免疫法测定胞内cAMP的含量。结果:Exenatide或融合蛋白GGH刺激大鼠β胰岛素瘤细胞RIN m5f后,选用100nmol/L IBMX作为cAMP保护剂,用DPBS为药物稀释剂,采用液氮—100℃反复冻融2次裂解细胞,最后用酶联免疫法可稳定的测定上清液中cAMP含量。结论:成功改良了融合蛋白GGH体外高通量生物学活性测定方法。运用此方法可快速鉴定融合蛋白GGH及其它GLP-1类似物的生物活性。
- 耿燕任怡琳许正宏窦文芳
- 毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响被引量：3
- 2013年
- 目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联。通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性。方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性。结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8%,两菌株生长无明显差异。结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性。
- 路庆鹏许正宏史劲松窦文芳
- 关键词：毕赤酵母GLP-1生物活性
- 融合蛋白GGH粉针剂制备工艺研究
- 2016年
- 目的：建立高效液相色谱法测定融合蛋白GGH原料和注射用粉针剂含量的方法,筛选制备粉针剂的辅料和p H,进行6个月的长期稳定性试验。方法：高效液相色谱采用Waters DELTA PAK C18色谱柱,流动相为乙腈和水,梯度洗脱20min,检测波长280nm。根据粉针剂的外形、复溶性、稳定性和活性保留率筛选填充剂及p H。结果：GGH在0.2~1.6mg/ml范围内线性关系良好,可用此方法进行制剂的含量检测;选用4%的甘露醇作为填充剂并调节p H为5.5,可以制备性质较为稳定的GGH冻干粉针剂。结论：可采用含量和纯度检测结合外观性状观察法用于粉针剂的制备工艺筛选,为申报新药提供参考。
- 钱建瑛许正宏窦文芳
- 关键词：融合蛋白粉针剂
- 应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量被引量：7
- 2011年
- 为实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH)的规模化制备,通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-ggh,并电转至经载体pPIC9K-ggh异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用免疫学方法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,在30℃,3%甲醇诱导80 h后GGH的表达量达到了491 mg/L,较GS115/F2提高了49.7%,通过荧光定量PCR发现GGH基因拷贝数在含有双质粒体系的GS115/F3中较出发菌株GS115/F2提高了26.7%。Western blotting杂交表明融合蛋白同时具有人血清白蛋白和人胰高血糖素样肽-1的抗原性。
- 王慧窦文芳张晓梅许泓瑜许正宏
- 关键词：毕赤酵母荧光定量PCRWESTERNBLOTTING
- 提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达:人干扰素毕赤酵母表达体系研究被引量：1
- 2011年
- 以毕赤酵母KM71/IH的hIFNβ-HAS表达体系为研究对象,较为系统地研究了不同因素引起的细胞相对活性变化与毕赤酵母外源蛋白表达的相关性。结果表明:(1)细胞相对活性变化与外源蛋白的表达成正相关;(2)处在对数生长中后期的细胞相对活性最高,更适合用于外源蛋白的表达;(3)诱导阶段的环境因素直接影响诱导期细胞相对活性,合适的甲醇浓度、诱导pH及温度是维持细胞高活性,促进外源蛋白高表达的关键。对于hIFNβ-HAS表达体系最佳诱导条件为:以培养21～24h的细胞为诱导种子,初始甲醇浓度为2%(V/V),pH6.0,25℃,细胞活性维持在98%以上,hIFNβ-HSA表达量高达45.6mg/L,较优化前提高了62.3%。
- 窦文芳张旦旦许泓瑜金坚许正宏史劲松陆震鸣
- 关键词：毕赤酵母
- 中温α-淀粉酶高产菌株的选育及其粗酶性质被引量：4
- 2011年
- 以从自然界中筛选的野生芽孢杆菌XLG-1为出发菌株,通过紫外线诱变及紫外线-氯化锂复合诱变筛选出高产中温α-淀粉酶的优异菌株XLG-51,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。初步研究了其所产的α-淀粉酶的酶学性质:通过SDS-starch-PAGE电泳与酶谱分析得该酶分子质量为60 ku左右,最适作用温度为60℃,最适作用pH范围为5.0～6.5,且在最适条件下具有较强的稳定性。以该菌株为生产菌进行5 L罐发酵实验,产酶达5298 U/mL。
- 李文秀张旦旦窦文芳许泓瑜许正宏史劲松陆震鸣
- 关键词：枯草芽孢杆菌Α-淀粉酶诱变
- 融合蛋白GGHN端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究被引量：1
- 2013年
- GGH是人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的简称,为研究N端添加丙氨酸的修饰对其活性的影响,通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌,并纯化得到终产物,完成了初步体外活性检测。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH类似物的基因片段,以pPIC9K为表达质粒构建了重组表达质粒,将双酶切和测序验证正确的重组质粒电转至分泌型菌株毕赤酵母GS115,然后经过MD平板筛选获得转化子,利用甲醇诱导表达72 h,SDS-PAGE检测上清产物与未修饰的GGH对比,得到阳性转化子。融合蛋白经过发酵液8 000 r/min离心10 min,0.45μm的微孔滤膜微滤,采用截留分子量为10 kD的超滤膜超滤20倍,再依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25层析柱。在RINm5f细胞上测cAMP的生成,通过与阳性对照的标准曲线对比发现,A-GGH活性比GGH提高10倍,表现出较好的体外活性。
- 冯均尚窦文芳张晓梅许泓瑜史劲松许正宏
- 关键词：类似物毕赤酵母纯化活性
- 基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化
- 2012年
- 以毕赤酵母人β干扰素表达体系为研究对象,考察与蛋白酶活性相关的营养和环境因素对外源蛋白hIFN-HAS表达/降解的影响。结果表明,pH、谷氨酸和EDTA是显著影响hIFN-HAS表达的3个因素。通过响应面分析得到hIFNβ-HAS表达的最优条件为pH 5.5、谷氨酸0.18%、EDTA 12 mmol/L,目的蛋白表达量为24.46 mg/L。发酵终产物的电泳结果表明:条件优化后,hIFNβ-HSA降解带明显变淡,说明营养和环境因素的优化一定程度上抑制了蛋白酶的活性,由此增加了目的蛋白的积累。
- 张旦旦窦文芳许正宏史劲松
- 关键词：毕赤酵母Β干扰素融合蛋白蛋白酶酶活性
- 融合蛋白GGH在小鼠体内的药效学评价被引量：1
- 2011年
- 目的探讨融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)对实验性β细胞轻度损伤的小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和胰岛功能的影响。方法对小鼠进行造模,血糖仪测定FBG,胰腺组织切片行HE染色,建立β细胞轻度损伤模型小鼠。实验分为正常对照组(normal control group,NC)、模型对照组(model group,DM)、GLP-1对照组、HSA对照组、Exendin-4(Ex-4)阳性对照组、GGH低(2 mg.kg-1)、中(6mg.kg-1)、高(18 mg.kg-1)剂量组(GGH 2、GGH 6、GGH18)治疗。记录14 d内的饮食、饮水、尿量、体重及FBG变化,放射免疫分析法测定空腹血清胰岛素水平(fasting seruminsulin,FINS),免疫组化方法观察胰岛β细胞增殖。结果 C57BL/6♂小鼠单剂量腹腔注射STZ 120 mg.kg-1 14 d后可成功制备稳定敏感的β细胞轻度损伤模型;治疗14 d,GGH中、高剂量组与DM组、GLP-1组、HSA组比较饮食、饮水、尿量减少(P均<0.05),FBG降低(P均<0.01),FINS升高(P均<0.05),胰岛细胞增殖增加(P均<0.05),GGH高剂量组的FBG、FINS与NC组、Ex-4组比较差异均无显著性(P均>0.05),胰岛细胞增殖与Ex-4组比较差异无显著性(P>0.05)。结论融合蛋白GGH通过促进β细胞的增殖和胰岛素的分泌而降低模型小鼠的高血糖,改善"三多一少"症状,其中GGH高剂量组的降糖药效与GLP-1受体激动剂Ex-4接近。
- 范翰李现丽窦文芳杜斌邱丽颖金坚许正宏
- 关键词：小鼠Β细胞损伤GLP-1融合蛋白降糖
- 融合蛋白(GLP-1_(A2G))_2-HSA的分离纯化及其活性评价被引量：4
- 2010年
- 建立简便、快速、高效的重组人血清白蛋白与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)突变串联体融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)的分离纯化方法。重组毕赤酵母菌株发酵产生的融合蛋白GGH的上清液通过超滤、染料配体亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析获得高纯度的样品,终回收率为33.1%,12%SDS-PAGE和HPLC检测纯度达到98%。体内活性测定结果表明,融合蛋白GGH在小鼠皮下给药8 h后仍能发挥显著的降血糖作用。结果表明建立的分离纯化方法较好的保留了融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的生物活性。
- 李现丽窦文芳张晓梅许泓瑜邱丽颖金坚许正宏
- 关键词：胰高血糖素样肽-1融合蛋白活性测定
