国家自然科学基金(30271177)
- 作品数：12 被引量：70H指数：4
- 相关作者：姚开泰肖东贾俊双肖高芳姚志芳更多>>
- 相关机构：南方医科大学中南大学广东省医学实验动物中心更多>>
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- 携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建被引量：1
- 2011年
- 目的构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW。方法 XhoI线性化pLenti-EF1a-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoI,接着BamHI酶切该片段,回收2722bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoRI线性化pFUGW,回收并补平EcoRI,然后BamHI酶切该片段,回收9174bp片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的SolutionI将其与连接用c-Myc-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUMGW。获pFUMGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒感染人胚肾细胞株293、肿瘤细胞株CNE1和C666以建立相应的病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUMGW,按标准程序生产的携带c-Myc和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染293、CNE1和C666。结论成功构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW,为相关后续研究打下了良好基础。
- 李艳青史俊文肖高芳肖东姚开泰
- 关键词：C-MYCEGFP慢病毒载体
- 稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立被引量：3
- 2013年
- 目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR-26a序列418bp,片段两侧添加XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点,In-Fusion克隆至pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT-miR26a。获得pLVT-miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞(Hep1-6)、人肝癌细胞(BEL-7402、HepG2、Sk-Hep-1、HepG2-luc),以建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞系;qRT-PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT-miR26a,按标准程序生产的携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。
- 赵文淘赵尊兰史俊文王胜纯林晓琳李静姚开泰肖东
- 关键词：慢病毒载体肝癌
- 慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立被引量：19
- 2008年
- 目的针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系,以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等,随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产;将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FT细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内,感染6～12h后,用相应培养基替换感染液,数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞。结果按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒(病毒上清或浓缩后的病毒)成功高效率感染293FT细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞;用浓缩后的病毒(携带EGFP基因)感染小鼠ES细胞,亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆。结论熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术,同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统,这些为相关后续研究打下了良好的基础。
- 贾俊双孙妍肖东姚开泰
- 关键词：慢病毒小鼠胚胎干细胞小鼠胚胎成纤维细胞
- 细胞可透过性Cre重组酶表达、纯化及生物活性检测(英文)被引量：1
- 2004年
- Cre/loxP系统由Cre位点特异重组酶和可被Cre特异性识别的loxP位点构成,该系统广泛用于条件性基因敲除和表达,以研究基因功能.为了表达和纯化一种细胞可透过性Cre重组酶(即His6 NLS Cre MTS);经IPTG诱导,在BL2 1(DE3)宿主菌成功表达His6 NLS Cre MTS融合蛋白,通过His BondNi NTA树脂分离并纯化了该蛋白质,随后借助细胞和非细胞的重组系统成功检测了His6 NLS Cre MTS的生物活性.
- 郭中敏徐康岳颖黄冰唐欢马芸洪迅陈系古肖东
- 关键词：CRE/LOXP系统纯化生物活性检测
- 慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠被引量：3
- 2010年
- 目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只(R3和R4)鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉(RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。
- 贾俊双肖高芳林晓琳张晟姚志芳杜文婷申红芬刘科饶子亮孙妍姚开泰肖东
- 关键词：红色荧光蛋白转基因小鼠
- 诱导性多潜能干细胞(iPS cells)——现状及前景展望被引量：36
- 2009年
- 主要从iPS细胞发展历程、获得iPS细胞的几个关键步骤(如基因导入方式、诱导iPS细胞所需因子组合与小分子化合物运用和体细胞种类选择等)、病人或疾病特异性iPS细胞、iPS细胞体内外诱导分化与其衍生物的临床应用和制备无遗传修饰的(genetic modification-free)iPS细胞的可行性与前景等方面对iPS细胞最新研究进展做评述.日本和美国研究小组先后用4种基因将小鼠(2006年8月)和人(2007年11～12月)的体细胞在体外重编程为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells),此后在短短两年多时间内,iPS细胞的研究和关注度呈爆炸式增长.体细胞重编程、去分化和多潜能干细胞来源等一系列热点问题再次成为干细胞和发育生物学等研究的热点和焦点.与胚胎干细胞(embryonic stem cells,EScells)一样,iPS细胞在体内可分化为3个胚层来源的所有细胞,进而参与形成机体所有组织和器官.迄今,在体外已由iPS细胞定向诱导分化出功能性的多种成熟细胞.因此,iPS细胞研究不仅具有重要理论意义,而且在再生医学、组织工程和药物发现与评价等方面极具应用价值.
- 申红芬姚志芳肖高芳贾俊双肖东姚开泰
- 关键词：体细胞重编程胚胎干细胞诱导性多潜能干细胞细胞治疗
- 携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建被引量：2
- 2010年
- 目的构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW。方法XhoⅠ线性化pLenti-EF1a-Sox2-IRES-EGFP,回收片段并补平XhoⅠ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.356kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的SolutionⅠ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUSGW。获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人胚肺成纤维细胞(HLFs)和人神经胶质瘤细胞(U87)以建立相应病毒感染体系。结果酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带Sox2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87。结论成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础。
- 姚志芳肖高芳史俊文王赫申红芬肖东姚开泰
- 关键词：SOX2EGFP慢病毒载体
- 携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc和EGFP基因小鼠肿瘤细胞株的建立被引量：1
- 2012年
- 目的构建稳定携带Oct4、Klf4、Sox2、c-myc(以下简称为OKSM)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的小鼠肿瘤细胞株。方法将载体pLentG-KOSM用NotI、XbaI线性化,并进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),以鉴定其结构。按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带OKSM和EGFP基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞(Hep1-6)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)和小鼠肺癌细胞(LLC),以建立相应病毒感染体系。结果 pLentG-KOSM确实含有OKSM4种基因,按标准程序生产的携带OKSM和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染Hep1-6、4T1及LLC,成功建立稳定携带OKSM和EGFP基因的小鼠肿瘤细胞株。结论成功构建携带OKSM和EGFP基因的Hep1-6、4T1、LLC细胞株,为相关的后续研究打下了良好基础。
- 贾琦珺史俊文申洪芬贾俊双肖东姚开泰
- 关键词：OCT4KLF4SOX2C-MYC
- 携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建被引量：2
- 2010年
- 目的构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW。方法SacⅡ线性化pLenti-EF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平SacⅡ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.565kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的SolutionⅠ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUOGW。获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B以建立相应病毒感染体系。结果酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B。结论成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础。
- 肖高芳姚志芳贾俊双李艳青鄢文肖东姚开泰
- 关键词：OCT4EGFP慢病毒载体
- 携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建
- 2009年
- 目的构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW。方法NheⅠ和NotⅠ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302;BamHⅠ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物,并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的SolutionI将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序。所构建载体命名为pFUM3GW。获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系。结果PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F。结论成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础。
- 申红芬贾俊双肖高芳姚志芳肖东姚开泰
- 关键词：EGFP慢病毒载体
