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猪链球菌2型溶血素sly基因的表达及其产物的纯化和活性研究被引量：1: 2007年; 目的克隆并表达猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly),为筛选SS2疫苗保护性抗原奠定基础。方法用PCR方法从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出溶血素基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30b(+)中,构建重组表达载体pET30b-sly。重组载体经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定后,转化大肠埃希菌(E.coli Rosetta)。IPTG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白,鉴定目的蛋白的免疫学活性以及溶血活性。结果PCR扩增的sly基因长度约为1500 bp,经测序分析,插入载体的sly基因序列准确并保持了正确的读框。经IPTG诱导的目的蛋白表达量约占总蛋白的30%,亲和层析纯化后,蛋白纯度达80%以上。Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的人血清发生特异性结合。溶血试验表明重组蛋白溶血素能使猪红细胞发生溶解,溶血价为256。结论成功构建了表达载体pET30b-sly,该载体可在大肠埃希菌中表达,表达蛋白具有免疫反应原性及溶血活性。; 刘丽娜胡福泉朱军民赵岩潘渠李明唐家琪; 关键词：猪链球菌2型活性研究

猪链球菌2型05ZYH33强毒株srtA基因敲除突变株的构建被引量：1: 2007年; 猪链球菌（Streptococcus suis，S．suis）2型是一种新发人兽共患病的病原，不仅可致猪败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎及心内膜炎，而且可感染人类引发严重的链球菌中毒性休克综合征（streptococcal toxic shock syndrome，SISS），病程凶险，病死率高，其致病机理尚未阐明。; 董亚青王长军郑峰潘秀珍李明王晶范红结唐家琪; 关键词：猪链球菌2型基因敲除链球菌中毒性休克综合征突变株强毒株心内膜炎

猪链球菌2型疫苗候选分子FBP的表达及免疫学活性研究被引量：6: 2008年; 目的表达SS2纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FBP),研究其免疫学活性,探讨其保护活性和作为疫苗候选分子的可能性。方法用PCR技术从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出fbp基因片段,插入表达载体pET-30b(+)中,构建重组表达载体pET30b-fbp。该载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化E.coli.Rosetta,IPTG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白。Western blot证实目的蛋白的分子量和免疫反应原性。重组蛋白免疫小鼠后收集多抗血清,间接ELISA检测其效价。结果PCR扩增的fbp基因长度约为1700bp,所构建重组表达载体酶切鉴定无误、测序证实碱基序列100%正确且保持正确读框。IPTG诱导表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的10%。亲和层析获得目的蛋白,纯度达80%以上。Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的病人血清发生阳性反应。重组蛋白免疫小鼠后血清效价达1∶25600以上。结论成功构建了表达载体pET30b-fbp,可在工程菌E.coli.Rosetta中表达;表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。; 刘丽娜胡福泉朱军民赵岩陈志瑾唐家琪; 关键词：免疫学活性

猪链球菌2型二元信号转导系统ciaR基因敲除突变株的构建及生物学功能研究被引量：4: 2009年; 目的构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33二元信号转导系统1094HK/1095RR的反应调节因子ciaR基因敲除突变株(ΔciaR),并研究ΔciaR的生物学功能。方法和结果基于同源重组原理筛选ciaR基因缺失株,PCR分析及Southern杂交结果均显示突变株构建成功。通过检测OD600值绘制生长曲线,发现突变株在37℃和40℃其OD600值均明显低于野生株;与40mmol/L过氧化氢共作用15min后涂板计数,突变株存活率明显低于野生株;不同pH值的培养基中培养,发现在pH5.0的酸性环境中突变株OD600值明显低于野生株;野生株与突变株对BALB/c小鼠攻毒(约1×109CFU/只),各10只,两组16h后均死亡9只。结论成功获得05ZYH33ciaR基因敲除突变株;发现删除ciaR基因会导致细菌的生长繁殖能力减弱,抗氧化应激能力下降,在酸性环境生长存活能力下降;但对小鼠毒力无差别。; 冯晓丹程功王晶王长军潘秀珍唐家琪; 关键词：信号转导系统猪链球菌2型基因敲除突变株分离菌株鼠源性

Ⅱ型猪链球菌二元信号转导系统2148hk／rr基因敲除突变体的构建被引量：4: 2008年; 构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体。构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为2148hk/rr编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选2148hk/rr编码基因敲除突变体。PCR分析和Southern杂交结果均显示2148hk/rr编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变体构建成功。筛选获得05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体,为阐明该调控系统在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。; 程功李明郑峰王晶王长军潘秀珍范红结唐家琪; 关键词：猪链球菌2型基因敲除突变体

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国家高技术研究发展计划(2006AA02Z455)