江苏省自然科学基金(BK2009087)
- 作品数：6 被引量：15H指数：1
- 相关作者：徐铁军王湘臻李梅王德广滕大才更多>>
- 相关机构：徐州医学院徐州医学院附属医院南京医科大学更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金徐州市科技计划项目江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 不同转染法用于第三代慢病毒包装系统包装效率的比较
- 2011年
- 目的 比较分别经磷酸钙转染法和脂质体转染法建立的第三代慢病毒包装系统的包装效率.方法 制备并纯化完整的重组慢病毒三质粒系统：转移质粒（PXZ171）、包装质粒（△NRF）以及包膜蛋白质粒（VSV-G）.分别用磷酸钙法和脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,72 h后收集病毒上清,批量快速测定法测定病毒滴度并进行比较.结果 磷酸钙转染法所产病毒滴度约达到脂质体转染法的1/10.结论 磷酸钙转染法获取的病毒滴度稍低,但价格相对便宜,病毒产量亦可满足实验要求.比较适合在普通实验室中开展.
- 井超徐铁军
- 关键词：慢病毒转染293T细胞
- 海马神经干细胞不同传代方法的比较被引量：13
- 2011年
- 背景:体外培养神经干细胞,在悬浮培养时由于自身增殖特性会形成球,传代时将会面临如何将细胞球分离成单细胞的问题。目的:寻求理想的大鼠海马神经干细胞传代方法,以获得大量可增生的神经干细胞以供研究。方法:分离新生1dSD大鼠海马神经干细胞,原代培养至五六天时,分别用机械吹打法、胰蛋白酶、TrypLE和Accutase消化法分离神经干细胞球。之后每7d传代1次,连续传代3次。分别于每次传代后第1天和传代后第4天计数活细胞比例和细胞球数目,实验重复3次。结果与结论:神经干细胞球经3种酶消化后获得的均是单细胞;经机械吹打后既有单个细胞,也有小细胞球分布于培养液中。在酶消化法中,Accutase消化法传代后神经干细胞的活细胞比例明显高于胰蛋白酶消化(P<0.01)和TrypLE消化法(P<0.05)。同时,Accutase消化法传代后新形成的细胞球数目也较其余各组多(P<0.01)。提示在实验条件下,Accutase消化法能够较好地将神经干细胞球分离成存活率较高、能快速形成新的克隆球的单个细胞,是较为理想的神经干细胞分离传代方法。
- 李梅王湘臻徐铁军
- 关键词：神经干细胞海马细胞培养传代免疫细胞化学
- 神经干细胞向神经元前体细胞分化过程中NMDA受体介导的电流变化
- 2011年
- 背景:NMDA受体是脑内主要的兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性受体,参与中枢神经系统许多重要的生理和病理过程。目的:观察体外培养的SD大鼠海马区的神经干细胞及神经前体细胞在发育过程中NMDA受体介导的全细胞电流的变化情况。方法:应用细胞免疫化学方法观察神经干细胞的nestin以及分化1,3,7d神经前体细胞的βⅢ-tubulin表达情况。应用全细胞膜片钳技术在-60mV钳制电压下记录神经干细胞和神经前体细胞电流。将神经干细胞和神经前体细胞和分为对照组和实验组,对照组加入无Mg2+的细胞外液;实验组加入10,20,50,100μmol/LNMDA。结果与结论:神经干细胞的NMDA受体未检测到介导电流产生;分化1,2d的神经元前体细胞未检测到电流;分化3,7d的神经元前体细胞能够检测到电流,随着NMDA剂量的增加电流也在增大;分化7d的神经元前体细胞在相同剂量的NMDA诱导产生的电流较分化3d的产生的电流大。提示:①实验中未检测到神经干细胞的NMDA介导电流产生。②神经前体细胞第3天时检测到NMDA介导电流。③随着神经前体细胞分化的进展,NMDA介导电流在增大。
- 王湘臻李梅胡莹莹于滋超王庆明徐铁军
- 关键词：神经元前体细胞神经干细胞NMDA受体膜片钳技术
- 幼年大鼠脑室下区N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位2B的表达及其细胞类型被引量：1
- 2012年
- 背景:神经干细胞表达有N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methy-D-aspartic acid receptor,NR)亚单位2B,深入研究其在幼年大鼠脑室下区的表达情况有助于揭示该区神经干细胞增殖、分化、迁移的机制。目的:观察NR2B在幼年大鼠脑室下区的表达及表达高峰期所在的细胞类型。方法:取出生后7,14,21,28dSD大鼠,制备5μm厚脑组织冰冻切片,观察脑室下区NR2B的表达,及其在出生后14d大鼠脑室下区所在的细胞类型。结果与结论:免疫组化结果显示NR2B在出生后7,14,21,28d大鼠脑室下区存在差异表达,于出生后14d时表达达高峰,以侧脑室外侧角旁表达最高;免疫荧光双标染色可见NR2B在脑室下区与胶质纤维酸性纤维蛋白、巢蛋白、β-Ⅲ微管蛋白共定位,以室管膜细胞最明显;而与NeuN在脑室下区无共定位。说明NR2B在幼年大鼠脑室下区的表达存在时空变化,可能在神经发生中发挥作用。
- 张伟高俊英许晶崔桂云
- 关键词：脑室下区神经干细胞巢蛋白
- 脑源性神经营养因子过表达促进大鼠神经干细胞向神经元分化
- 2011年
- 目的构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,探讨BDNF过表达对神经干细胞(NSCs)向神经元分化的影响。方法采用RT-PCR法,以大鼠海马组织RNA为模板,扩增BDNF基因,定向克隆到pEGFP-N1载体中,用脂质体法转染pEGFP-N1-BDNF表达载体至NSCs中,然后用RT-PCR鉴定BDNF的表达,免疫组织化学方法鉴定NSCs向神经元的分化情况。结果成功构建了pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,BDNF在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达。重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后,能够较空质粒转染的NSCs产生更多的神经元(P<0.01)。结论 BDNF过表达能够显著促进大鼠NSCs向神经元方向分化。
- 欧阳长杰滕大才曲德伟王德广徐铁军
- 关键词：脑源性神经营养因子神经干细胞分化反转录-聚合酶链式反应
- 大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达被引量：1
- 2012年
- 构建脑源性神经营养因子（BDNF）基因真核表达载体，检测其转染COS-7细胞后的表达。方法：从大鼠海马组织中提取总RNA，采用RT-PCR方法获得目的基因片段，克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接。将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中，用RT-PCR鉴定BDNFmRNA的表达，免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平。结果：克隆了BDNF的cDNA，并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF，经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；免疫印迹法分析显示，转染48h时，COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主，在96h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主。结论：成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体，并且在COS-7细胞中得到高效表达，BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外，在不同时间点分泌组合不同。
- 欧阳长杰滕大才曲德伟王德广徐铁军
- 关键词：脑源性神经营养因子基因重组质粒基因表达COS-7细胞
