江苏省基础研究计划(BK2009-071)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 相关作者：朱瑞宇陈蕴金坚高明珠丁鹏鹏更多>>
- 相关机构：江南大学教育部更多>>
- 发文基金：江苏省基础研究计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达被引量：1
- 2012年
- 目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。
- 高明珠朱瑞宇陈蕴金坚
- 关键词：启动子真核细胞基因表达
- 锌指蛋白转录抑制因子145′非翻译区内部核糖体进入位点的活性
- 2016年
- 目的 检测锌指蛋白转录抑制因子14（positive regulatory domain zinc finger protein 14,PRDM14）5忆非翻译区（5忆untranslated region,5忆UTR）内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）的活性。方法 PCR扩增PRDM14 5忆UTR各截短序列的基因及全长基因,分别插入至双荧光素酶和红绿荧光报告基因中,构建重组质粒p RL-PRDM14 S1-FL、p RL-PRDM14 S2-FL、p RL-PRDM14 S3-FL及p G-PRDM 14-R。将各重组质粒分别转染HEK293细胞,检测PRDM14 5忆UTR IRES元件的活性、内部剪切位点和自身启动子的活性及影响IRES活性的序列。将重组质粒p RL-FL/5忆UTR分别转染HCT-8/WT、Hep-2、Bel7402/WT和NIH3T3细胞,检测各细胞中PRDM14 5忆UTR IRES元件的活性。结果 PRDM14 5忆UTR具有内部核糖体进入位点元件活性;不具有内部剪切位点和自身启动子活性;PRDM14 5忆UTR的活性激活中心位于25~60 nt,活性抑制中心位于60~95 nt;除NIH3T3细胞外,其他细胞均具有IRES活性。结论 PRDM14 5忆UTR具有典型的IRES活性,为今后深入研究PRDM14表达的调控机制奠定了基础。
- 丁鹏鹏马文囡朱瑞宇陈蕴金坚
- 关键词：内部核糖体进入位点萤火虫荧光素酶
- 转录因子GATA3mRNA5＇非翻译区内部核糖体进入位点的活性
- 2016年
- GATA3（GA—TA-binding protein-3）是锌指蛋白GATA家族成员之一，在细胞的增殖和分化中起着重要的作用，GATA3在细胞中的异常表达也是导致众多肿瘤形成的原因。通过对GATA3mRNA5’非翻译区（untranslatedregion，uTR）进行分析，发现其UTR长达557bp并且具有复杂的二级结构。将GATA3mRNA5’UTR克隆至双荧光素酶报告载体pRL—FL中，瞬时转染至细胞中然后对细胞进行无血清培养后，发现GATA3mRNA5’UTR介导的翻译明显升高。将GATA3mRNA5’UTR克隆至△pRL—FL载体上，瞬时转染细胞后检测萤火虫荧光素酶的表达，发现GATA3mRNA5’UTR不具有隐含启动子，进而确定GATA3mRNA5’UTR具有内部核糖体进入位点（intemal ribosome entry sites，mES）元件；进一步对GATA3mRNA5’UTR进行序列截短分析，发现GATA3mRNA5’UTRq△345～557bp区间可能是抑制IRES活性的调控元件，而95～344bp区间则是IRES元件的主要活性中心调控域，并且在不同的细胞系中GATA3IRES元件的活性存在显著的差异。该研究结果表明，GATA3mRNA的5’UTR可参与GA]队3的表达调控。
- 陶义芬马晶朱瑞宇段作营金坚李华钟
- 关键词：GATA3内部核糖体进入位点荧光素酶
