辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(L2010589)
- 作品数：5 被引量：1H指数：1
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- 相关机构：中国医科大学更多>>
- 发文基金：辽宁省教育厅高等学校科学研究项目辽宁省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达被引量：1
- 2013年
- 目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。
- 翟永贞王志峰冯国和
- 关键词：病毒蛋白质类蛋白质CCHO细胞
- ICAM-1基因修饰的日本脑炎DNA疫苗诱导BALB／c鼠脾脏树突状细胞功能的研究
- 2011年
- 细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）在基因疫苗方面已有研究报道，有学者研究表明ICAM-1能提供给T细胞共刺激信号，并且证实该刺激信号通路独立于CD86介导的T细胞活化的第二信号通路。
- 翟永贞周立夫马力冯国和
- 关键词：ICAM-1BALB/C鼠DNA疫苗诱导细胞功能日本脑炎基因修饰树突状
- ICAM-1编码基因对乙型脑炎DNA疫苗树突状细胞功能的影响
- 2013年
- 目的:研究细胞间粘附分子1(ICAM-1)编码基因对日本脑炎(JE)DNA疫苗脾脏树突状细胞功能的影响。方法:套式RT-PCR法获取BALB/c鼠ICAM-1编码基因,构建重组子pJME/ICAM-1和pICAM-1,脂质体法转染上述质粒于CHO细胞,Western blot法检测转染的CHO细胞中目的蛋白表达。实验分5组,包括:pJME/ICAM-1、pJME+PICAM-1、pJME、JE灭活疫苗和pcDNA3.1(+)免疫组,以不同免疫原肌注免疫BALB/c小鼠,流式细胞仪检测经不同免疫原免疫鼠后脾脏DC表型、抗原吞噬功能以及混合淋巴细胞反应。结果:融合表达重组质粒pJME/ICAM-1和单质粒pICAM-1经鉴定构建正确。pJME/ICAM-1组CD11c+CD86+DC和CD11c+ICAM-1+DC比例分别为(6.92±1.40)%、(7.18±0.57)%,高于其它免疫组(均P<0.05);pJME/ICAM-1和pJME+pICAM-1组DC表面CD80和MHCⅡ表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);pJME/ICAM-1与pJME+pICAM-1组内吞能力明显增强,平均荧光强度分别为437.11±47.60、416.67±29.12,显著高于其它组(P<0.05)。比较不同免疫原对细胞分裂的作用,以pJME/ICAM-1组最强,(73.69±7.32)%CD4+T细胞发生分裂,(45.40±2.57)%CD8+T细胞发生分裂,显著高于对照组(P<0.05)。结论:ICAM-1编码基因能够促进JE DNA疫苗脾脏树突状细胞的成熟,能够提供独立或放大B7分子的协同刺激信号。
- 翟永贞马力冯国和
- 关键词：DNA疫苗细胞间粘附分子1树突状细胞共刺激分子
- 乙脑病毒prME蛋白与鼠GM-CSF编码基因的融合构建与表达
- 2010年
- 目的构建乙脑病毒prME蛋白与鼠GM-CSF融合基因重组子并建立稳定细胞表达株。方法套式-RT-PCR法从BALB/c鼠脾组织获取GM-CSF编码基因,用限制性内切酶从含乙脑病毒prME蛋白基因重组子获取prME蛋白基因,定向克隆至同一真核表达载体pcDNA3.1(+)不同酶切位点,构建重组子pJME/GM-CSF并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJME/GM-CSF转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。Western blot法检测转染的CHO细胞中融合蛋白表达。结果 pJME/GM-CSF经BamH I/EcoRI和BamH I/Not I酶切释出的插入子片段(2001 bp、2472bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白相对分子量(Mr)为85×103。结论 pJME/GM-CSF成功构建,转染的CHO细胞可稳定表达融合蛋白。
- 翟永贞周言马力冯国和
- 关键词：脑炎病毒病毒蛋白质类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子CHO细胞
- 日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定
- 2012年
- 目的构建日本脑炎病毒核心蛋白(JEV C蛋白)基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应。方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoRI/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定;PEG/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化入酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用;用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达。结果重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致;成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均>0.8,在SD/-Trp/X/A培养基上均不生长;经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC。结论成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pGBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础。
- 丁德平冯国和
- 关键词：日本脑炎病毒酵母双杂交技术质粒构建诱饵蛋白
