国家自然科学基金(30872250) 作品数:5 被引量:16 H指数:3 相关作者: 张大志 仝君 许晓梅 王丹 童师雯 更多>> 相关机构: 重庆医科大学附属第二医院 中国人民解放军总医院 重庆医科大学 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 重庆市卫生局医学科研项目 更多>> 相关领域: 医药卫生 更多>>
乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达 被引量:1 2011年 目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况。方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,再将目的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建包含HBV抗原基因的重组表达质粒pcDNA3.1(+)-HBs,pcDNA3.1(+)-HBe,pcDNA3.1(+)-HBc。阳性克隆用限制性内切酶酶切鉴定正确后用脂质体2000分别瞬时转染HepG2细胞,同时转染LO2细胞作为对照,Western blot和免疫荧光技术分别检测各抗原基因产物在细胞内的表达。结果:成功扩增出HBV各抗原基因片段,通过酶切测序鉴定证明成功构建了包含HBV抗原基因的重组表达质粒pcDNA3.1(+)-HBs,pcDNA3.1(+)-HBe,pcDNA3.1(+)-HBc,Western blot和免疫荧光检测到目的蛋白在转染细胞中的正确表达。结论:本实验成功构建包含HBV抗原基因的真核表达载体,并能在体外真核细胞中表达相关抗原蛋白,为进一步研究各抗原的生物学功能奠定了实验基础。 仝君 张大志关键词:乙肝病毒 抗原基因 真核表达载体 瞬时转染 HBV慢性携带小鼠中CD27和CD11b标记NK细胞亚群的变化 被引量:4 2019年 目的评价乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带小鼠中CD27和CD11b标记自然杀伤(NK)细胞亚群的变化。方法将pAAV-HBVl.2质粒采用高压水动力法尾静脉注入C57BL/6小鼠体内,作为造模组,空载质粒作为对照组;检测不同时间点肝功能和病毒学指标判断HBV质粒慢性携带动物模型构建情况;采用流式细胞术检测脾脏和肝脏中NK细胞及CD11b联合CD27划分的NK细胞亚群的频数;采用Graphpad Prism软件进行统计学分析。结果小鼠HBV持续携带模型构建成功。与对照组相比,HBV慢性携带小鼠的脾脏和肝脏中的NK细胞频数差异均无统计学意义(P值均>0.05)。CD27联合CD11b将NK细胞划分为CD11b+CD27-(CD11b+SP)、CD11b+CD27+(DP)、CD11b-CD27+(D27+SP)和CD11b-CD27-(DN)四个亚群,与对照组相比,HBV慢性携带小鼠的脾脏中四个NK细胞亚群的频数差异均无统计学意义(P值均>0.05)。HBV慢性携带小鼠的肝脏中DN NK细胞亚群的频数与对照组比较显著增多(P<0.001),CD11b+SP细胞亚群的频数显著减少(P<0.05),DP和CD27+SP两个NK细胞亚群频数差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论HBV慢性携带小鼠肝脏NK细胞亚群分布异常,DN NK细胞亚群的频数明显增多,CD11b+SP细胞亚群的频数显著减少。 张琼方 张大志关键词:淋巴细胞亚群 自然杀伤细胞 HBeAg能上调新生儿脐带血中调节性T细胞的表达 被引量:3 2011年 目的:观察HBsAg阳性产妇新生儿脐带血CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞(RegulatoryTcell,Treg)的数量,探讨HBeAg在新生儿HBV持续性感染中的作用。方法:共收集63例HBsAg阳性产妇新生儿脐带血,按照产妇产前HBeAg状态分为A组33例HBeAg阳性,B组30例HBeAg阴性,C组22例HBsAg阴性产妇做为对照组。利用三色流式分析法分析新生儿脐带血单个核细胞(Cord blood monocytes,CBMCs)中的Treg的频数。并检测产妇及其脐带血中的HBV血清标志物和HBV DNA水平。结果:A组33例其中有24例脐带血HBeAg阳性;B组和C组脐带血HBeAg均为阴性。所有HBsAg阳性产妇新生儿脐带血HBVDNA均为阴性。新生儿脐带血HBeAg水平与产妇外周血HBeAg水平无关(P>0.05)。与B组和C组相比较,A组新生儿脐带血中的Treg百分比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而B组和C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。A组脐带血Treg百分比与产妇HBVDNA、HBeAg及脐带血HBeAg水平无关(P>0.05)。结论:HBeAg可以通过胎盘到达胎儿体内,可能通过上调Treg的比例,使HBeAg阳性产妇新生儿在宫内对HBV产生免疫耐受。 许晓梅 施可庆 刘建 孙江川 刘菊莲 冯丽娟 张大志关键词:HBSAG HBEAG 脐带血 免疫耐受 HBV感染者血清AST/ALT比值及HBV血清标志物联合检测的辅助诊断价值研究 被引量:6 2011年 为检测HBV感染者在疾病不同阶段血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、AST/ALT比值及HBV血清标志物水平,探讨它们之间的相互关系,采用速率法、ELISA法分别检测收集的296例HBV感染者和99名健康体检者的血清ALT、AST水平及HBV血清标志物,并计算其对应的AST/ALT比值。结果显示,慢性乙型肝炎(CHB)组的HBeAg阳性率高于乙型肝炎肝硬化(LC)组和原发性肝癌(HCC)组;HCC组的抗-HBe阳性率高于CHB组和LC组;CHB组、LC组、HCC组的ALT、AST水平均高于对照组;CHB组的AST/ALT比值小于对照组,LC组的AST/ALT比值和HCC组的AST/ALT比值均高于对照组和CHB组(P<0.05);三疾病组中HBeAg阳性患者的AST、AST/ALT比值与抗-HBe阳性患者的AST、AST/比值ALT没有显著性差异(P>0.05),ROC曲线下面积CHB组以AST/ALT比值为最大,为A=0.71;LC组以AST为最大,A=0.664;HCC组以AST为最大,A=0.675。患者在HBV感染后不同疾病阶段,AST水平、AST/ALT比值发生规律性变化,HBeAg阳性率逐渐降低,抗-HBe阳性率相应升高,提示肝细胞损伤与体免疫紊乱有关,AST/ALT比值可为临床中HBV相关疾病有辅助诊断价值。 仝君 童师雯 王丹 张大志 田亚平关键词:AST/ALT比值 HBV血清标志物 应用组织芯片检测Pin1在肝炎、肝硬化、肝细胞性肝癌组织中的表达 被引量:2 2010年 目的:利用组织芯片技术检测肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-proplyl isomerase1,pin1)在正常、肝炎、肝硬化及肝癌组织中的表达,了解pin1在肝细胞性肝癌发生、发展不同阶段的表达情况及与临床病理参数的关系。方法:用免疫组织化学染色法在组织芯片上同时检测10例HBsAg阳性病毒性肝炎、40例肝硬化、19例肝细胞性肝癌及34例正常肝组织中pin1的表达情况,并分析pin1在不同肝脏疾病组织中的表达差异。结果:pin1在HBsAg阳性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞性肝癌及正常肝组织中的阳性表达率分别为80%(8/10)、82.5%(33/40)、100%(19/19)、55.8%(19/34),肝细胞性肝癌组织中的阳性表达率明显高于HBsAg阳性病毒性肝炎、肝硬化及正常肝组织,同时肝癌中pin1的表达强度也明显高于HBsAg阳性病毒性肝炎、肝硬化和正常肝组织(P<0.001),而在HBsAg阳性病毒性肝炎、肝硬化和正常肝组织中pin1阳性表达率及表达强度均无差异无统计学意义(P>0.001);肝细胞性肝癌组织中pin1的表达与病理分级、有无淋巴结转移及临床分期无相关性(P>0.05)。结论:pin1参与了HBsAg阳性病毒性肝炎,肝硬化到肝细胞性肝癌的疾病进展过程,在肝细胞性肝癌的发生和发展中发挥了一定作用。 许晓梅 胡怀东 廖勇 张大志关键词:PIN1 肝硬化 肝细胞性肝癌 组织芯片