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国家自然科学基金(31072143): 作品数：14 被引量：115H指数：5; 相关作者：张杰张永光马小元丁耀忠王俊更多>>; 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃农业大学达州职业技术学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国际科技合作与交流专项项目更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备: 2017年; 目的原核表达美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus,NA-PRRSV)N蛋白,并制备多克隆抗体。方法以NA-PRRSV QH-08毒株的RNA为模板,扩增N蛋白编码片段,克隆入原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6 h。采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达的重组蛋白,复性后的重组N蛋白与弗氏佐剂混合乳化,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,制备兔抗NA-PRRSV-N蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验检测多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测血清抗体效价。结果经PCR、双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET30a-NA-PRRSV-N构建正确;重组N蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为24 000,纯度可达95%以上,可与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体能够识别重组N蛋白和全病毒抗原,抗体效价>1∶25 600,显著高于商品化疫苗组。结论成功在大肠埃希菌中表达了NA-PRRSV N蛋白,并制备了其多克隆抗体,为NA-PRRSV检测方法的建立奠定了基础。; 欧云文王勤马炳马小元代军飞贾宁丁耀忠张永光张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白原核细胞基因表达多克隆抗体

非洲猪瘟病毒的分子病原学及致病机理研究进展被引量：45: 2017年; 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种烈性传染病,具有急性、高热、高病死率等特征,主要暴发于非洲、东欧国家、俄罗斯及高加索地区。目前,该病缺乏有效的疫苗和治疗方法,给病情爆发地区的养猪业造成严重的影响。ASFV的主要靶细胞是网状内皮细胞和单核—巨噬细胞,造成细胞凋亡,影响宿主的免疫系统,进而表现出相应的疫病特征。ASFV具有基因组较大、基因型较多且易变异等特征。文章主要从分子病原学和致病机理方面对ASFV的研究情况进行综述,为ASF的防控提供理论依据。; 欧云文阎传忠张杰马炳代军飞张永光贾宁; 关键词：非洲猪瘟病毒宿主致病机理

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白研究进展被引量：7: 2016年; 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种遍布于全世界的高度传染性疾病,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。感染PRRSV后,最先在机体内进行表达的是非结构蛋白(nonstructural proteins,NSPs),PRRSV基因组编码区经翻译后至少产生14种NSPs(NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7a、NSP7b、NSP8、NSP9、NSP10、NSP11、NSP12),这些NSPs在病毒增殖、病毒毒力、免疫学特性等方面都发挥着重要作用。作者就NSPs的研究进展进行简要概述,以期为PRRS疫苗研发及技术防控奠定基础。; 刘亚丽丁耀忠张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白免疫学特性

光定量PCR技术在常见猪繁殖障碍性疫病中的应用: 目前,猪繁殖障碍性疫病给全球的养猪业造成严重的经济损失,严重制约养猪业的怏速健康的发展。引起猪繁殖障碍性疫病的病毒主要是猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒...; 欧云文马小元王俊张永光张杰

牛浮舰蛋白-2在真核细胞中的表达与鉴定被引量：1: 2014年; 采用基因重组法将牛浮舰蛋白-2(Flotillin-2)基因的整个开放阅读框(ORF)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(B),通过脂质体法将重组质粒转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,利用Western-blot分析目的基因的表达情况。为确定35ku的小蛋白来源,采用融合PCR法构建突变体,分别利用标签抗体和针对浮舰蛋白-2的抗体鉴定突变体表达蛋白的特性。测序结果表明,成功构建了Flotillin-2基因的全长ORF及其突变体mFlotillin-2的重组质粒。Western-blot结果显示,Flotillin-2基因的全长ORF在CHO细胞中表达时除出现与预期大小相一致的48ku目的蛋白带外,还有1个35ku的条带。基因序列分析发现,在第430~438位核苷酸存在1个似Kozak序列(CGCATGGGC)。将ATG突变成GCT(丙氨酸)后,Western-blot结果显示,突变前后35ku的小蛋白始终存在。本研究以pcDNA3.1(-)/Myc-His(B)为载体,实现了牛Flotillin-2基因的全长ORF的真核表达,证明了35ku小蛋白并不是由于重新起始翻译导致的,而可能是浮舰蛋白-2在翻译过程中的裂解产物。; 孙东杰赵峰张杰; 关键词：中国仓鼠卵巢细胞突变体真核表达融合PCR

猪细小病毒1型VP2基因的原核表达及反应原性分析被引量：1: 2017年; 旨在研究猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白(第155-439位氨基酸)的抗原性,为开发PPV1的检测方法奠定基础。以PPV1型AV31株的DNA为模板,扩增获得849 bp的目的片段,扩增产物克隆入p ET30a(+)原核表达载体,构建p ET30aPPV1-VP2(155-439 aa)重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3);在37℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDS-PAGE分析表明,该VP2编码基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为39 k D;Western blot检测结果表明,该重组蛋白与PPV1阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PCV2阳性血清不发生交叉反应。该实验成功构建了PPV1-VP2(155-439 aa)原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性。; 欧云文马小元张杰丁耀忠张永光贾宁; 关键词：VP2基因原核表达反应原性

PRRSV细胞受体CD163 SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：1: 2017年; 为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163在宿主感染PRRSV过程中的表达情况,根据CD163的序列在其保守区设计了1对特异性引物,基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立了一步法检测CD163的实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验及样品检测试验。结果表明:建立的方法具有较高的特异性,PRRSV的其他几个受体(CD151、HS)均为阴性反应;对CD163的检测下线为10个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对样品进行3次组内和组间重复试验,变异系数(CV)<2%,具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间段CD163的转录水平进行检测,结果显示CD163在48小时时的mRNA含量明显高于其他各时间段。说明所建立的针对CD163的检测方法完全可以应用于临床样品的检测。; 马小元丁耀忠王俊张杰张永光; 关键词：SYBR 荧光定量RT-PCR MARC-145细胞

猪繁殖与呼吸综合征病毒及其病毒样颗粒疫苗的研究进展被引量：4: 2017年; 自北美地区出现猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以来,此病已有几十年的历史,给养猪业带来了毁灭性的打击。感染此病后呼吸系统症状增加,主要侵袭肺部,病变明显而且继发其他病毒和细菌性疾病;怀孕母猪会产生繁殖障碍,导致流产,产死胎和木乃伊胎等。迄今为止临床上仍然使用灭活疫苗和弱毒疫苗来预防此病,但是这两种疫苗都有不可调和的缺陷,并不能提供完全保护力。新型基因工程疫苗病毒样颗粒(VLPs)疫苗是目前的研究热点,因其不具有感染性病毒的遗传物质,仅含有病毒的几种主要结构蛋白,不会造成感染,安全系数高,免疫效果好而被普遍接受。但是猪繁殖与呼吸综合征病毒的VLPs疫苗仍处于实验室开发阶段,不过已经给各类疾病疫苗的研发提供了一个新的思路。文章对猪繁殖与呼吸综合征及其病毒样颗粒疫苗进行综述。; 王俊马小元欧云文张永光张杰; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征免疫应答常规疫苗

PRRSV青海株与其他疫苗株对Marc-145细胞的毒力比较: 2015年; [目的]研究青海PRRSV毒株对Marc-145细胞的适应性和增殖速率以及致病性和毒力等。[方法]以PRRSV青海毒株QH08、海利和诺倍威CH-1R经典毒株、GW-HR毒株及其在Marc-145细胞上的传代毒株为研究对象,对4种毒株及其传代毒株的TCID50值和细胞病变作用(CPE)出现的时间进行比较,探讨了PRRSV青海毒株对Marc-145细胞的适应性、在Marc-145细胞内的增殖速率以及该毒株的毒力。[结果]随着PRRSV传代次数的增加,病毒在Marc-145细胞中的增殖速率加快,对细胞的适应性和毒力都增强。与其他3个毒株相比,青海株毒力最强;CPE出现的时间提前,说明病毒在Marc-145细胞中的复制周期缩短,表明不同毒株PRRSV的F10比F1在Marc-145细胞中具备更好的复制能力和致病性。[结论]4株PRRSV传代毒10个代次的TCID50总趋势为渐变上调的趋势,CPE出现的时间总体上呈逐渐缩短的趋势。; 施冲旭张杰; 关键词：PRRSV TCID50 病毒毒力

南非2型口蹄疫病毒VP1基因的核苷酸及其氨基酸序列分析被引量：3: 2016年; VP1基因的遗传衍化关系是口蹄疫病毒分型的依据,而且许多重要的抗原位点也都位于VP1蛋白上。为了对南非2型口蹄疫病毒(SAT2-FMDV)VP1的编码基因序列及其氨基酸序列进行分析,为南非2型口蹄疫的诊断及疫苗设计提供理论基础,试验从NCBI下载大量的南非1/2/3型口蹄疫病毒(SAT1/2/3-FMDV)的1D2A2B基因片段,通过序列分析选择相似性较低的序列代表SAT1/2/3,将选中的代表序列连接于p UC57载体上进行合成,再对合成的含目的序列的穿刺菌进行划板、挑单克隆、摇菌、提质粒,得到重组质粒初步进行酶切鉴定后进行测序,测序正确后采用DNAStar软件包对这些合成序列进行分析。结果表明:SAT2-FMDV VP1的编码基因核苷酸序列变异度较大;虽然SAT2口蹄疫病毒VP1蛋白上主要抗原位点位置与其他血清型的差异性并不大,但是关键氨基酸已发生变化。; 刘亚丽丁耀忠马小元张杰张永光; 关键词：口蹄疫病毒 VP1基因核苷酸序列氨基酸序列

国家自然科学基金(31072143)

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