国家自然科学基金(31072155)
- 作品数：9 被引量：21H指数：3
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- 相关机构：江苏省农业科学院南京农业大学上海交通大学更多>>
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- 正常屠宰猪致病性猪链球菌7型的鉴定和特性研究被引量：1
- 2011年
- 从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌,命名为HA100111。该细菌呈链球菌的特征形态,药敏试验表明该菌株对多种抗生素有耐药性。经PCR及序列分析,确定该分离菌株为猪链球菌7型,其毒力因子基因型为gdh+/m rp-/epf-/sly-/orf2+/fbps+。动物致病性试验表明,该菌对ICR小鼠和新西兰兔有较强的致病性,对ICR小鼠半数致死量为2.67×107CFU,但是对仔猪无明显致病作用。得出结论,在正常猪扁桃体中可携带致病性的猪链球菌7型。
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- 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型GN061215生物学特性及蛋白质表达的影响被引量：1
- 2013年
- 为了了解次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)对猪链球菌2型GN061215致病力的影响机制,利用同源重组技术,敲除猪链球菌2型GN061215的impdh基因,重组后的GN061215命名为GN061215(△IMPDH),比较GN061215与GN061215(△IMPDH)培养特性、生化特性、致病力以及基因转录水平差异。结果显示impdh基因敲除后,引起GN061215生长曲线迟缓期延长,降低了GN061215生长曲线平台期OD600峰值,同时截短了GN061215菌株成链长度;GN061215、GN061215(△IMPDH)对46种代谢底物利用能力一致,对2种代谢底物利用存在差异;GN061215(△IMPDH)对Balb/c小鼠的致病力较GN061215菌株有一定程度的下降。SDS-PAGE显示GN061215(△IMPDH)菌体的粗提蛋白质条带较GN061215有显著减少;基因芯片比较GN061215、GN061215(△IMPDH)基因转录差异发现,下调基因中存在36个关联核糖体大、小亚基合成的基因,而在上调基因中不存在该类基因,表明impdh基因的丢失影响了GN061215菌株核糖体大、小亚基的合成,进而显著减少了GN061215菌株菌体蛋白质的表达,这可能与GN061215菌株毒力的下降有关。
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- 关键词：猪链球菌2型核糖体蛋白质表达谱芯片
- 猪链球菌2型粘附相关因子荧光定量PCR检测方法的建立被引量：3
- 2014年
- 为了建立定量检测猪链球菌2型(SS2)粘附相关因子mRNA转录水平的荧光定量PCR方法,根据已报导的SS2粘附相关因子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、分选酶A(SrtA)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)及其管家基因aroA,用GenBank登录的核苷酸序列,设计特异性引物,提取SS2总RNA,经RT-PCR扩增和克隆了各粘附相关因子的核苷酸片段,以构建含有各自引物扩增序列的重组质粒,建立检测各粘附相关因子SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法起始模板数的对数与荧光信号达到所设定荧光阈值所经历的循环数(Ct)之间线性关系好,相关系数均达到0.995以上;扩增产物形成单一的特异性熔解峰;初始模板的检出下限达到了1μl 1.0×102拷贝数;组内变异系数小于2%,说明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。
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- 关键词：猪链球菌2型STREPTOCOCCUSSUIS
- 猪IL-1β与IL-18 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立被引量：2
- 2011年
- IL-1β和IL-18是重要的促炎症细胞因子,在介导机体炎症反应中起重要作用。为了建立在体外定量检测猪细胞因子IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,依据GenBank中登录的猪细胞因子基因IL-1β、IL-18及管家基因β-actin核苷酸序列,设计特异性引物,经RT-PCR从3D4猪肺泡巨噬细胞系中克隆和扩增了上述3个因子核苷酸片段,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性模板,建立了检测IL-1β、IL-18及β-actin SYBR GREEⅠ荧光定量PCR方法。该方法起始模板数与Ct值之间线性关系好,相关系数达到0.990以上;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;敏感性高,初始模板的检出下限达到了1μl 1.0×102拷贝;重复性好,组内变异系数均小于4%。
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- 关键词：促炎症细胞因子IL-1ΒIL-18
- 猪链球菌2型江苏分离株菌毛相关基因特点及菌株毒力鉴定被引量：1
- 2012年
- 利用PCR技术对猪链球菌2型(SS2)江苏分离株的菌毛相关基因进行扩增,根据菌毛相关基因分布特点对菌株分型,并进行动物试验评估。结果 24株SS2中A型占70.8%,B型占29.2%。其中从病猪分离的13株SS2均为A型;而从健康猪扁桃体中分离的11株SS2 A型占36.3%,B型占63.7%。动物试验结果表明A型菌株的毒力强于B型。以上结论说明猪链球菌2型江苏分离株可以根据菌毛相关基因特点进行分型,并利用分型结果来评估菌株的毒力强弱及潜在危害性。
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- 关键词：猪链球菌2型毒力
- 猪链球菌2型粘附相关因子MRP、FBPS和CPS2J荧光定量PCR检测方法的建立(英文)被引量：1
- 2013年
- [目的]建立定量检测SS2粘附因子mRNA转录水平的荧光定量PCR方法。[方法]根据已报导的SS2相关粘附因子(包括MRP、FBPS、CPS2J)及管家基因aroA,以GenBank登录的核苷酸序列,设计特异性引物,利用RTPCR扩增和克隆各粘附因子的核苷酸片段,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性模板,建立检测各粘附因子的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。[结果]利用优化的Real-time PCR体系建立了各粘附因子和aroA的扩增曲线、标准曲线和溶解曲线。标准曲线表明,起始模板数与Ct值之间线性关系好,相关系数R2均达0.995以上。此方法特异性好,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;敏感性高,初始模板的检出下限达1.0×102拷贝数/μl;重复性好,组内变异系数均小于2%。[结论]该研究为在分子水平上探究不同SS2菌株对细胞粘附差异的机制提供了技术手段。
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- 关键词：荧光定量PCR检测猪链球菌2型实时PCR
- 猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：5
- 2012年
- 为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。
- 周俊明何孔旺倪艳秀俞正玉茅爱华吕立新温立斌张雪寒郭容利李彬王小敏
- 关键词：猪链球菌2型MRP原核表达间接ELISA
- 猪链球菌2型溶血素成熟蛋白的原核表达及其生物学特性与免疫保护性被引量：4
- 2013年
- 根据猪链球菌2型溶血素(SLY)的基因序列设计引物,以江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增除信号肽序列外的溶血素成熟蛋白基因,并克隆到表达载体pET-32α(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌经1 mmol/L IPTG诱导,在37℃下4 h时表达产物(分子量约为7.2×104)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白质的20%,表达产物在上清和包涵体中各占一半。将上清经镍柱亲和层析纯化,纯化蛋白质经Western blotting鉴定呈阳性,对绵羊红细胞、鸡红细胞的溶血效价分别为1.707×105HU/mg、4.267×104HU/mg,并可引起HEp-2和Vero细胞的颗粒增多、圆缩和脱落。纯化蛋白质对BALB/c小鼠的免疫保护率为83.3%(5/6)。这为进一步研究SLY致病机理和研制猪链球菌新型疫苗奠定了基础。
- 倪艳秀何孔旺周俊明汪伟吕立新俞正玉茅爱华温立斌张雪寒李彬胡屹屹郭容利王小敏陆承平
- 关键词：猪链球菌2型原核表达生物学特性免疫保护性
- 猪链球菌2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析被引量：3
- 2013年
- 为探明猪链球菌2型(SS2)感染的致病机制,利用荧光定量PCR方法,分析不同SS2菌株对3D4/21猪肺泡巨噬细胞各炎症相关细胞因子mRNA体外转录水平的影响。结果显示强毒菌株ZY05719刺激细胞因子转录水平高于其impdh缺失株ZY05719(Δimpdh)和无毒菌株HA0609及低毒菌株CS100322-1。ZY05719诱导多个细胞因子mRNA过度转录,包括IL-18、IL-8和IL-12等。除IL-10外,HA0609诱导其他细胞因子mRNA上调转录;而CS100322-1刺激后,绝大部分细胞因子mRNA处于稳定状态。不同毒力SS2菌株影响细胞因子mRNA转录,且这种影响具有时间上的依赖性。SS2具有调节炎性细胞因子转录的能力,其结果介导炎症反应及白细胞趋集于感染部位,这可能是SS2引起脑膜炎炎症特征的机制之一。
- 汪伟何孔旺倪艳秀吕立新周俊明张雪寒俞正玉茅爱华温立斌王小敏李彬郭容利
- 关键词：猪链球菌2型猪肺泡巨噬细胞炎症相关细胞因子荧光定量PCR
