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非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性被引量：4: 2009年; 目的在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒（dengue virus serotype Ⅰ，DENV-1）的抗体基础上，评价已建立的非结构蛋白Ⅰ（nonstructural protein 1，NS1）抗原捕获酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析抗体中和活性的可行性，为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法。方法使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区（envelope protein domain Ⅲ，EDⅢ）免疫5只BALB／c小鼠制备单克隆抗体（简称单抗），采用间接ELISA、间接免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）和免疫印迹法（Western Blot）对单抗进行筛选及鉴定；同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔，制备多克隆抗体血清；以传统噬斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test，PRNT）作为参比方法，采用NS1抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测。结果获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清，且被PRNT试验证明均具有中和活性，四株单抗腹水（1A1、1B3、3D3、9D6）和兔多抗血清中和效价分别为1：1024、1：512、1：256、1：4096和1：4096。使用NS1抗原捕获EHSA法检测不到PRNT中和效价最低的3D3抗体对DENV-1有中和能力，而检测其余3株单抗（1A1、1B3、9D6）和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果，分别为1：32、1：32、1：128和1：128。结论简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性，该方法适合于高效价中和抗体的筛选，有望成为评价疫苗效果的方法之一。; 温坤丁彦青丘立文潘玉先蔡建飘岳彩峰狄飚车小燕; 关键词：登革热病毒病毒包膜蛋白质类酶联免疫吸附测定病毒非结构蛋白质类

1型登革病毒初次感染患者血清中和抗体的动态反应分析被引量：2: 2012年; 目的研究感染登革病毒(DENV)后,机体DENV中和抗体产生的特点及其动态变化规律。方法采集2006年DENV-1初次感染患者在发病2周之内的,以及同一组患者在2010年随诊期间的血清标本,用本实验室建立的以群特异性DENV NS1抗原捕获ELISA为基础的,可同时测定4型DENV中和抗体的微中和试验(ELISA-MNT),对这两组血清中的DENV中和抗体滴度进行检测。这两组血清标本均检测了全部抗4型DENV的中和抗体。此外,2010年的血清标本还检测了抗3种不同毒株的DENV-1(其中包括1株标准株和2株临床分离株)的中和抗体。结果 2006年和2010年这两组不同时间段的血清标本对全部4型DENV均可显示出一定程度的交叉中和抗体反应,其中,2006年的血清标本交叉中和抗体反应更为明显,表现为其最高的中和抗体针对的甚至是DENV-2,而不是预计中的DENV-1;2010年的血清标本中最高的中和抗体滴度针对的是同型的DENV-1。Mann-whitney U检验显示:对于同型的抗DENV-1中和抗体滴度,2010年的血清要明显高于2006年的血清(U=86.500,P=0.000),但异型中和抗体滴度在两组血清标本中无明显改变。Friedman检验显示,尽管同属DENV-1,但2010年的血清标本对3种不同毒株的DENV-1的中和抗体滴度之间还是存在显著差异(χ2=12.123,P=0.002)。结论 4型交叉中和抗体反应是DENV感染后,尤其是在感染早期中和抗体的产生特点,但只有同型DENV中和抗体滴度可随时间的推移而发生明显的上升;然而即使是同属于一种血清型,不同毒株之间的中和抗体也可能存在差异。; 胡冬梅李洁王大虎狄飚丘立文王压娣丁细霞车小燕; 关键词：登革病毒中和抗体

Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定被引量：8: 2010年; 目的利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区（DENV-1—4 ED Ⅲ），获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ。方法PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因，构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒。酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115，涂板后经G418梯度浓度筛选，获得多株抗G4184．0mg／ml的高拷贝菌株，扩大培养后，利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白，表达上清用Ni—NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定。结果成功构建pPIC9K—DENV-1～4 ED Ⅲ重组质粒，高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白，纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳，相对分子质量约为12×10^3，与实际相符。免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合。结论成功通过毕赤酵母高效分泌表达I～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白，这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究。; 蔡建飘钱菲王嘉颖赵莹徐晓晶金维荣车小燕; 关键词：登革热病毒毕赤酵母基因表达调控病毒

登革热中和抗体的研究进展被引量：2: 2010年; 登革热是一种蚊媒传染病,主要发生在热带和亚热带地区.近年来,随着全球气候变暖、人员活动的增多及城市化进程等诸多原因,登革热的发病率和死亡率均呈迅速上升趋势,成为疫区最重大的公共卫生问题.; 胡冬梅车小燕; 关键词：登革热中和抗体亚热带地区全球气候变暖公共卫生问题蚊媒传染病

登革病毒包膜蛋白Ⅲ区IgG抗体捕获酶联免疫吸附试验的建立及应用被引量：1: 2013年; 【摘要】目的建立一种高度敏感和特异的登革病毒（denguevirus，DENV）包膜蛋白Ⅲ区（envelopeproteindomain1]I，EDm）IgG抗体的检测方法，并探索这种方法在登革热诊断和血清流行病学调查中的应用价值。方法以毕赤酵母表达系统制备的重组全长DENVEDm作为抗原，建立DENVEDmIgG抗体捕获ELISA。用这种方法检测来自同一组35例DENV一1初次感染患者在2006年发病期和2010年随访期的血清标本，并将其检测的敏感性与商品化的PanbioDENVIgG抗体捕获ELISA试剂盒进行对比。结果DENVEDHIIgGELISA试剂盒对发病期和随访期血清标本检测的灵敏度分别是87％（20／23）和94％（33／35），而Panbio DENV IgGELISA试剂盒对这两个时期血清标本检测的灵敏度分别是71％（25／35）和0。DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒对两个时期血清检测灵敏度差异无统计学意义（X^2=0．946，P=0．331）。对于发病期血清标本，DENVEDⅢIgG ELISA试剂盒与Panbio DENV IgG ELISA试剂盒检测的灵敏度比较，差异无统计学意义（X^2=1．924，P=0．165）；而对随访期血清标本，DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒检测灵敏度高于Panbio DENV IgG ELISA试剂盒，差异有统计学意义（X^2=62．432，P=0．000）。结论DENVEDⅢIgG抗体捕获ELISA试剂盒对登革热患者发病期血清及随访期血清中IgG抗体的检测均具有高度的敏感性，有可能成为DF诊断和血清流行病学调查的有效工具。; 胡冬梅蔡建飘王大虎狄飚丘立文王压娣陈月丁细霞车小燕; 关键词：登革热病毒免疫球蛋白G 血清学试验

登革病毒非结构蛋白1氨基端抗原性分析及其检测登革病毒感染动物血清被引量：2: 2010年; 目的精确分析登革病毒(dengue virus,DENV)非结构蛋白1(non-structural protein1,NS1)氨基(N)端抗原性和免疫原性,探讨NS1N端多肽用于分型检测DENV感染可行性。方法合成4型DENV标准株NS1蛋白N端1-15氨基酸残基序列多肽(D-1P1、D-2P1、D-3P1和D-4P1),采用ELISA方法检测多肽同各型DENV NS1型特异性单抗和各型DENV分别免疫小鼠血清的反应性,竞争抑制法进一步验证单抗和阳性多肽反应特异性。分析4型DENV标准株NS1N端1-15氨基酸残基序列多肽在Pubmed中已报道的各型DENV分离株中的保守性。结果 6株DENV-1NS1型特异性单抗(5A48A3,5A65A2,5B29A1,5B71A8,5C29A3和5E68A17)特异性的同D-1P1反应;6株DENV-2NS1型特异性单抗(5D21A1、5E19A5、5A62A12、5A70A4、5E30A5和5E48A15)特异性的同D-2P1反应。D-1P1仅识别DENV免疫小鼠血清,其他多肽同各型DENV免疫小鼠血清反应无差异。DENV-1、2、3、4NS1N端保守性依次为98.96%、89.09%、83.58%和57.81%。结论 DENV-1NS1N端是DENV-1血清型特异性线性表位,该多肽可用于研制诊断DENV-1感染试剂盒;DENV-2NS1N端是DENV-2血清型特异性表位,以上研究有助于DENV亚单位疫苗和DENV感染分型诊断试剂盒的研制。; 陈月潘玉先邱立文丁细霞车小燕; 关键词：表位

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国家自然科学基金(30671874)

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