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Ser176/180磷酸化位点突变的IKKα真核表达载体的构建及鉴定: 2015年; 目的构建Ser176/180磷酸化位点突变的核因子κB抑制剂激酶α(IKKα)真核表达载体。方法通过PCR获得带有IKKαSer176/180突变位点和无义突变KpnⅠ位点的片段,以及带有无义突变KpnⅠ位点的片段,两片段分别经过HindⅢ/KpnⅠ以及KpnⅠ/EcoRⅠ双酶切,载体pEGFP经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切后连接。共聚焦显微镜技术观察激活型/死型p EGFPIKKαKA/KD融合蛋白在真核细胞中的定位及其对P65核质易位的影响。Western blot法检测重组蛋白表达。结果测序显示载体构建成功。pEGFP-IKKαKA分布在细胞核和细胞质,并能使P65发生核穿梭。pEGFP-IKKαKD主要分布在细胞质,不能使P65发生核质易位。Western blot结果显示出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建IKKα磷酸化位点激活型及死型的真核表达载体,在真核细胞中可有效表达。pEGFP-IKKαKA/KD在真核细胞中蛋白表达呈现不同定位,对下游P65的核质穿梭调控发挥不同效应。; 何岩郑倩倩朱亚勤; 关键词：真核表达载体

人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定被引量：1: 2011年; 目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论成功构建了MAP3K7全长的GST重组表达载体,确定了GST-MAP3K7融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的融合蛋白,为进一步研究MAP3K7蛋白的生物学功能奠定了基础。; 冯艳玲刘彩红朱亚勤; 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达

人IKKγ基因重组载体的构建及在原核体内的表达纯化: 2013年; 目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定后,重组载体转化至原核细胞中并进行诱导表达,以SDS-PAGE凝胶电泳染色鉴定融合蛋白的表达。融合蛋白经GSTbeads沉降后,Western blot分析、鉴定融合蛋白的表达及纯化情况。结果将人IKKγ亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-1,酶切、测序鉴定无误。经诱导得到高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳染色后可见高表达条带。Westernblot鉴定经GSTbeads沉降后的蛋白,在74kD鉴定出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-,并在原核细胞内表达,融合蛋白可以经GSTbeads沉降用于GST-pulldown实验。; 郭文东朱亚勤

hTFF3基因真核表达载体构建及表达鉴定: 2011年; 目的克隆人肠三叶因子基因hTFF3,构建重组真核表达载体pEGFP-C1-TFF3,并在真核细胞中表达。方法应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从真核细胞中扩增得到人TFF3的全长序列,克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中,经酶切、PCR鉴定后测序证实克隆成功。将重组载体转至真核细胞,荧光显微镜观察下转染效率,同时采用RT-PCR、Western blot技术检测外源基因TFF3的表达。结果成功将hTFF3基因克隆到真核表达载体中,酶切片段与预期大小一致(200 bp)。在荧光显微镜下观察转染后的细胞可见明显的绿色荧光,RT-PCR及Western blot结果表明:转染后的细胞中TFF3在转录和翻译水平的表达均有明显提高。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-TFF3,并在真核细胞中显著表达,为进一步研究TFF3因子的生物学功能奠定了基础。; 郑倩倩郭文东朱亚勤; 关键词：肠三叶因子克隆

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辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2009S108)