山东省农科院重大成果培育基金(2006YCG012)
- 作品数：8 被引量：30H指数：3
- 相关作者：杨宏军杨少华王长法仲跻峰高运东更多>>
- 相关机构：山东省农业科学院山东农业大学四川农业大学更多>>
- 发文基金：山东省农科院重大成果培育基金山东省农业科学院高技术自主创新基金山东省优秀中青年科学家科研奖励基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 无乳链球菌CAMP因子(cfb)的克隆及原核表达质粒的构建被引量：1
- 2008年
- 提取无乳链球菌的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到PMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有768bp的ORF,可编码含256个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成同源性为98.4%。挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32 a+/cfb。这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。
- 王向柳王长法杨少华杨宏军阿合买提.买买提高运东仲跻峰
- 关键词：无乳链球菌克隆
- 奶牛子宫内膜炎致病菌的16S rRNA序列鉴定被引量：11
- 2009年
- 【目的】对奶牛产后子宫内膜炎致病菌进行16S rRNA序列鉴定。【方法】从产后子宫内膜炎患牛子宫分泌物中分离致病菌,通过细菌培养、纯化、分离、革兰氏染色和生化试验进行初步鉴定。选取代表性菌株11株,利用细菌通用引物,通过PCR方法,对其16S rRNA基因的核苷酸序列进行扩增,将扩增产物与pMD19-T载体连接构建克隆载体,经PCR和双酶切鉴定正确后测序,测序结果与GenBank中已注册菌株的16S rRNA基因序列进行比对。【结果】共分离到致病菌株60株,有代表性的11株细菌归类为:SD01为琼氏不动杆菌,SD02为粪肠球菌,SD03为金黄色葡萄球菌,SD04为中间葡萄球菌,SD05为溶血葡萄球菌,SD06为鲁菲不动杆菌,SD07为无乳链球菌,SD08为芽孢杆菌,SD09为枯草芽孢杆菌,SD10为大肠杆菌,SD11为假单胞杆菌。【结论】通过国际公认的16S rRNA序列鉴定技术,准确鉴定出引起奶牛子宫内膜炎的致病菌种类,为临床治疗该病提供了理论依据。
- 张洪波杨宏军何洪彬杨少华王长法高运东仲跻峰葛利江
- 关键词：奶牛子宫内膜炎RRNA
- 金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能区基因的克隆和原核表达被引量：5
- 2008年
- 【目的】克隆和表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白A(Fnbp A)的功能基因。【方法】采集奶牛急性乳腺炎乳样,分离金黄色葡萄球菌,提取其DNA作为模板,利用设计合成的特异性引物,对金黄色葡萄球菌进行FnbpA功能基因的PCR扩增。回收目的基因并连接到T载体,鉴定后进行测序,然后将FnbpA基因连接到pET-32a(+)质粒中,经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。【结果】PCR产物经电泳成像,仅金黄色葡萄球菌在1.7 kb处出现特异性条带,测序发现其与GenBank公布的FnbpA序列的同源性为98%;蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现,在80 ku处出现特异性条带。【结论】试验成功地克隆到FnbpA基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,蛋白量为33.4%,为进一步研究金黄色葡萄球菌粘附素基因工程疫苗奠定了基础。
- 杨宏军高运东王长法杨少华仲跻峰赵宏坤
- 关键词：金黄色葡萄球菌乳腺炎粘附素
- 奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达
- 2009年
- 以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%。构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达。
- 杨钦王长法杨宏军杨少华高运东仲跻峰彭广能
- 关键词：金黄色葡萄球菌克隆
- 奶牛乳腺炎大肠杆菌csgC基因的克隆及序列分析
- 根据GenBank上发表的curli菌毛csgc基因序列,设计了一对特异性引物。从患乳腺炎的奶牛乳汁中分离出致病性大肠杆菌,经生物学鉴定后,提取全基因组DNA为模板,PCR扩增出csgC基因,连入pMD18-T克隆载体,...
- 王林锋杨宏军杨少华王长法高运东仲跻峰葛利江
- 关键词：大肠杆菌
- 文献传递
- 牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析被引量：3
- 2009年
- 根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。
- 杨钦王长法杨宏军杨少华高运东仲跻峰彭广能
- 关键词：金黄色葡萄球菌溶血素克隆
- 奶牛乳腺炎大肠杆菌csgC基因的克隆及序列分析
- 2008年
- 根据GenBank上发表的curli菌毛csgC基因序列,设计了一对特异性引物。从患乳腺炎的奶牛乳汁中分离出致病性大肠杆菌,经生物学鉴定后,提取全基因组DNA为模板,PCR扩增出csgC基因,连入pMD18-T克隆载体,测序。结果表明,扩增片段含有333个核苷酸,编码111个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的大肠杆菌W3110的全基因组DNA中的csgC基因序列最相近,氨基酸序列同源性为99.7%。Curli菌毛csgC基因的克隆,为获得重组csgC蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。
- 王林锋杨宏军杨少华王长法高运东仲跻峰葛利江
- 关键词：大肠杆菌
- PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌被引量：7
- 2007年
- 为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法,依据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增Nuc基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为694bp;其他菌株未出现条带。敏感性检测的最低浓度为1.25×103cfu/mL。本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度高的特点。
- 杨宏军高运东王长法杨少华仲跻峰赵宏坤
- 关键词：金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎
- 金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗在小白鼠模型的免疫效力评价被引量：3
- 2009年
- 目的:以小白鼠为试验模型,检测金黄色葡萄球菌α-溶血素基因工程蛋白单位疫苗的抗体效价水平和免疫保护力,初步评价此亚单位疫苗的免疫效力。方法:Bradfrod法对目的蛋白进行蛋白含量测定,Geoffroy法测定目的蛋白半数溶血效价和活性,建立ELISA方法测定抗体效价,并且通过攻毒得出疫苗免疫保护力。结果:纯化的目的蛋白在53kDa处显示单一条带,蛋白含量为0.1278mg/ml;溶血比活为8012.5HU/mg;所有试验小鼠在首免一周后采集的血清中都检测到了特异性抗体,而抗体效价开始时呈逐渐上升趋势,达最高值后随时间延长逐渐降低。结论:纯化的目的蛋白达到电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性,蛋白疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律。
- 张海燕杨宏军王长法何洪彬仲跻峰杨少华马卫明
- 关键词：基因工程亚单位疫苗免疫效力
