国家自然科学基金(81271316)
- 作品数：10 被引量：12H指数：2
- 相关作者：杨志军徐如祥戴宜武张业森郭永坤更多>>
- 相关机构：北京军区总医院首都医科大学附属复兴医院第三军医大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- hTfR报告基因慢病毒载体构建及其在神经干细胞的表达研究被引量：2
- 2013年
- 目的探讨人转铁蛋白受体（hTfR）基因慢病毒载体构建方法及其在神经干细胞（NSCs）中的表达情况,为NSCs的MR分子成像提供实验基础。方法利用聚合酶链反应技术伊CRl扩增hTfR基因，并克隆到pLenti6.3载体，构建出慢病毒表达载体pLentil6．3-hTfR-IRES-EGFP。利用Lipofectin2000试剂将PLP1、PLP2、PLP-VSVG和pLenti6．3-hTfR-IRES-EGFP共转染293T细胞进行慢病毒包装，48h后收集病毒上清，体外感染NSCs。细胞流式筛选稳定表达hTfR的细胞，通过实时定量PCR和Westernboltting检测hTfR的表达，细胞免疫荧光技术对过表达的hTfR进行亚细胞的定位。结果成功构建危珊基因慢病毒表达载体，包装的慢病毒颗粒成功感染NSCs。实时定量PCR和Westernboltting鉴定出hT瓜在NSCs中过表达，hTfR基因表达相对值为2．275±0．281。细胞免疫荧光检测到过表达的hTfR主要在细胞膜上表达。NSCs分化后，hTfR在胶质细胞和神经元中稳定表达。结论本研究所用方法能成功构建hTfR慢病毒表达载体并筛选出稳定表达hTfR的NSCs系,为下一步活体内移植NSCs行MR分子成像实验研究奠定了基础。
- 郭永坤张业森刘春颖戴宜武黄瑾姚慧吴炳山姚学勤杨志军徐如祥
- 关键词：转铁蛋白受体慢病毒载体神经干细胞增强型绿色荧光蛋白
- 低氧环境对胶质瘤细胞增殖的影响被引量：2
- 2018年
- 目的探究低氧环境对胶质瘤细胞增殖能力的影响并进一步验证可能参与细胞增殖调节的信号通路。方法设计5%氧气含量条件下培养U87细胞为实验组,21%氧气含量条件培养U87细胞为对照组,以CCK-8(Cell Counting Kit,CCK8)试剂盒检测增殖活力,极限稀释法检测自我更新能力及单克隆能力,PCR实验及Western Blot实验检测中相关m RNA和蛋白表达。结果实验组胶质瘤细胞较对照组明显增殖,自我更新能力及单克隆能力增强,β-连环蛋白(β-catenin)、C-myc原癌基因(C-myc)的m RNA及蛋白表达量上调,而糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)m RNA及蛋白表达量下调。结论低氧微环境能通过激活经典Wnt信号通路(canonical Wnt/β-catenin pathway)上调Wnt通路增殖相关蛋白如C-myc,促进U87系胶质瘤细胞增殖。
- 刘晨杨志军徐如祥戴宜武罗丹孙移坤王震
- 关键词：胶质瘤低氧增殖
- 人转铁蛋白受体基因慢病毒表达载体的构建和鉴定
- 2015年
- 目的将人转铁蛋白受体(hTfR)基因克隆到慢病毒表达载体pLENTI6.3,并鉴定其正确性,为活体干细胞MR分子成像提供实验基础。方法利用聚合酶链反应技术(PCR)扩增hTfR基因,并克隆到pLENTI6.3载体;经过菌落PCR初步筛选、Bam H1酶切鉴定和测序鉴定构建的pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP重组载体。结果通过PCR技术成功扩增了hTfR基因;hTfR基因片段重组到pLENTI6.3载体;菌落PCR和酶切鉴定,凝胶电泳结果均显示得到和理论大小相符的片段;DNA测序结果与Genbank序列完全一致。结论 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP慢病毒表达载体构建成功,为下一步进行活体干细胞MR分子成像实验研究奠定基础。
- 杨志军郭永坤张业森戴宜武姚学勤徐如祥
- 关键词：转铁蛋白受体慢病毒载体干细胞磁共振成像
- 转铁蛋白受体基因在大鼠脑内表达成像的研究被引量：1
- 2013年
- 基因治疗是目前神经系统疾病的一种重要前沿治疗方法,已应用于多种疾病的治疗[1],病毒载体作为一种基因转移工具已被广泛用于基因治疗和细胞分子生物学研究[2].转铁蛋白受体基因是目前研究较多的磁共振报告基因之一[3],其配体转铁蛋白能够通过配体-受体系统通过血脑屏障[4].我们以转铁蛋白受体基因（TfR）为研究对象,利用核共振成像（MRI）的活体示踪技术将这些探针特异性结合的脑内转基因神经细胞.一、材料与方法1.材料：健康成年SD大鼠12只（清洁级）,Buker Sigma 7.0T超导型磁共振,转铁蛋白纳米铁螯合物（Tf-USPIO）购自北京万德高科.
- 张业森郭永坤姚慧徐如祥戴宜武杨志军
- 关键词：成年SD大鼠转铁蛋白受体基因成像脑内细胞分子生物学
- 磁共振报告基因示踪神经干细胞的研究进展
- 2013年
- 近年来,随着分子影像学技术的进步,细胞示踪技术取得了长足的进步.为了能够对移植后的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）及其分化细胞与宿主自身神经细胞加以鉴别和示踪,经常需要在干细胞移植前对其进行合适的标记.同时,研究人员非常希望能够在合适的示踪剂帮助下,利用无创伤性影像学技术识别移植后NSCs,活体监测NSCs在脑内的存活、迁移、整合乃至成瘤情况,借此来正确评价NSCs移植的疗效,并作为客观评价神经功能恢复程度的指标.当前细胞治疗在临床多种疾病的应用逐渐开展和深入,如何示踪和定量到靶器官或病灶的细胞是急需解决的问题,也是细胞治疗临床推广应用的关键技术之一[1],特别是干细胞治疗以及以干细胞为载体的基因治疗是目前医学领域的研究热点.
- 张业森杨志军徐如祥
- 关键词：神经干细胞核磁共振报告基因示踪
- 2种神经干细胞移植方法对宿主脑损伤和移植物维系的影响被引量：1
- 2015年
- 目的比较2种神经干细胞（NSCs）颅内移植方法对宿主脑损伤和移植物维系的影响。方法体外原代培养NSCs并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记，将NSCs单细胞悬液（5×10^5个，5μL）定向注射到42只健康成年C57BL／6小鼠两侧大脑运动皮层内，左侧颅骨采用磨钻钻孔，右侧采用微量进样器钻孔。移植后1d、2d、3d、7d、14d、21d和28d采用随机数字表法各选取6只小鼠处死，观察脑大体标本，HE染色观察脑移植区的损伤，免疫荧光双重标记染色Brdu／神经元核抗原（NeuN）、Brdu／神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）分析脑移植区NSCs、神经元和星形胶质细胞的分布情况。结果（1）与微量进样器钻孔侧相比，磨钻钻孔侧脑组织结构破坏较严重，移植后1～3d神经细胞坏死明显，并伴有大量红细胞外溢及炎症细胞浸润，7d时可见瘢痕组织形成，直到28d仍可见较多瘢痕组织聚集在移植区。（2）移植后1～3dBrdu标记的NSCs分布较为集中，7～21d可见NSCs明显迁移并分化为神经元和星形胶质细胞．左侧脑移植区可见大量星形胶质细胞．而神经元分布较少，右侧则相反；（3）与左侧比较，右侧脑移植区各时间点Brdu、NeuN阳性细胞百分率较高，GFAP阳性细胞百分率较低，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论采用微量进样器钻孔较磨钻钻孔能有效减轻移植损伤，明显提高NSCs存活率，有利于神经元生长，并减少胶质瘢痕形成。
- 高谋徐如祥杨志军董勤张洪钿朱建伟刘宁邹明明籍新潮
- 关键词：神经干细胞脑损伤星形胶质细胞
- 两种干细胞对颅脑创伤炎症反应调控作用的对比研究被引量：3
- 2015年
- 目的比较神经干细胞（neural stem cells,NSCs）与间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植对颅脑创伤（traumatic brain injury,TBI）后炎症反应的调控作用。方法将264只成年雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组（54只）和TBI组（162只）,采用自由落体脑打击装置制备TBI模型并于伤后12 h进行NSS评分,将3~7分者按随机数字表法分为3组,每组54只,于伤后24 h将离体培养的同品系小鼠成体NSCs、MSCs和PBS分别定向注射到创伤模型鼠脑内。于移植后24、72 h和7 d处死动物,取脑组织病理切片染色,观察脑损伤修复和免疫细胞浸润情况;分别提取脑组织mRNA和蛋白检测细胞因子表达量。结果 1NSCs或MSCs移植7 d后,脑损伤较PBS处理组局限,组织内渗出减少。2NSCs或MSCs移植72 h和7 d后,脑组织内浸润的小胶质细胞/巨噬细胞数量明显少于PBS处理组（P〈0.05）;NSCs移植7 d后,脑内浸润的T细胞数量明显少于PBS处理组（P〈0.05）。3MSCs移植后IL-6和TNF-αmRNA和蛋白水平在各时间点均低于PBS处理组（P〈0.05）;NSCs移植后IL-10 mRNA水平在24 h和72 h明显高于PBS处理组（P〈0.05）,其蛋白水平在72 h和7 d也较PBS处理组和MSCs移植组明显升高（P〈0.05）。结论 NSCs与MSCs可影响TBI后炎症反应中免疫细胞浸润和细胞因子表达,二者调控作用既有相同之处,也有明显差异。
- 高谋徐如祥杨志军董勤姚慧张洪钿杨阳刘宁陈晨朱建伟邹明明籍新潮
- 关键词：神经干细胞间充质干细胞颅脑创伤炎症反应细胞因子
- Tf-USPIO纳米微粒的合成及TfR转基因神经干细胞过表达的研究
- 2016年
- 目的合成Tf-USPIO纳米微粒以及建立稳定表达TfR的神经干细胞。方法利用慢病毒转染神经干细胞,通过流式细胞仪筛选出稳定表达TfR的神经干细胞,运用WB检测其表达水平。将Tf与USPIO进行偶联,合成Tf-USPIO纳米微粒,通过DLS方法测出USPIO和Tf-USPIO的直径分别为(36±0.7)nm,(43.5±0.08)nm。结果慢病毒成功的转染神经干细胞,通过流式细胞仪器筛选出稳定表达的神经干细胞,并用WB证实了TfR的过表达;通过偶联的方法合成了稳定的Tf-USPIO微粒。结论成功构建了TfR神经干细胞系,合成出稳定的Tf-USPIO纳米微粒。
- 杨志军白妙春张业森郭永坤戴宜武
- 关键词：转铁蛋白受体
- 阿维菌素对胶质母细胞瘤U251细胞增殖、凋亡的影响及其机制探讨被引量：1
- 2017年
- 目的观察阿维菌素(AVMs)对胶质母细胞瘤U251细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其相关机制。方法传代培养U251细胞,将细胞分为药物实验组和阴性对照组,药物实验组给予不同浓度的AVMs处理,阴性对照组不加AVMs。取药物实验组细胞,分别给予2、4、6、8、10、12μmol/L的AVMs,采用MTT法测算给药24、48、72 h后U251细胞的增殖抑制率。取药物实验组细胞,分别给予4、8μmol/L的AVMs培养72 h后,测算各组细胞凋亡率,检测各组细胞线粒体膜电位及细胞中的Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白。结果 2、4、6、8、10、12μmol/L的AVMs作用于U251细胞后,细胞增殖抑制率逐渐升高,AVMs作用24、48、72 h后U251细胞增殖抑制率也逐渐升高;AVMs对U251细胞的增殖抑制作用呈时间、剂量依赖性(P均<0.01)。AVMs作用72 h时对U251细胞增殖的IC_(50)为5.220μmol/L。阴性对照组与药物实验组4、8μmol/L亚组的细胞凋亡率分别为5.2%±0.16%、31.5%±0.43%、52.4%±0.72%,细胞线粒体膜电位分别为92.4±2.52、85.2±1.32、45.3±0.75,三组细胞凋亡率和线粒体膜电位相比,P均<0.01。阴性对照组和药物实验组4μmol/L亚组、8μmol/L亚组细胞中Caspase-3、Bax蛋白相对表达量依次升高,Bcl-2蛋白相对表达量依次降低(P均<0.01)。结论 AVMs可抑制U251细胞增殖并促进其凋亡,作用机制可能与降低细胞线粒体膜电位、调节凋亡相关蛋白表达有关。
- 罗丹罗亮杨志军黄佛宝王燕燕
- 关键词：阿维菌素脑胶质母细胞瘤U251细胞线粒体膜电位
- USPIO标记大鼠骨髓源神经干细胞体外磁共振成像研究被引量：2
- 2016年
- 目的 应用磁共振成像技术（MRI）观察超小超顺磁性氧化铁（USPIO）欣诺（Sinerem）标记后的大鼠骨髓源神经干细胞体外成像情况.方法 分离大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成神经干细胞.以200μg/ml的浓度105个细胞用不同的自旋回波序列T1WI、T2WI与T2＊WI在2％的琼脂糖凝胶中模拟在体环境分别行4.7T扫描确定最佳的扫描序列.将不同浓度（0、25、50、100、200、500μg/ml）Sinerem和干细胞共孵育培养过夜标记后置于2％的琼脂糖凝胶中,以自旋回波序列T2＊WI磁共振干细胞成像;并在磁共振下观察不同数量细胞200 μg/ml Sinerem标记细胞（101个,102个,103个,104个,105个）的信号情况.观察细胞在浓度200 μg/ml（106个）标记时经长期培养不同时间点时的信号变化.结果 MRI扫描结果提示序列T2＊WI扫描的敏感性最强.不同浓度的Sinerem标记细胞的磁共振信号强度不同,随着Sinerem浓度的升高MRI信号呈降低趋势,浓度为500 μg/ml时信号强度最低,肉眼观察可看到浓度100 μg/ml以上标记细胞的MRI的信号强度明显低于对照样品,可进行区分.标记细胞数量达103个及以上时在磁共振下其信号变化能被观察到.106个标记细胞的信号随培养时间的延长逐渐增加,4w时仍能在磁共振下显示可区分的低信号.结论 利用Sinerem标记的骨髓源神经干细胞体外可在MRI下呈现可视区别的低信号影,T2＊WI序列是最敏感的序列;信号强度的高低可用于评估标记细胞的数量.Sinerem标记的细胞可用于磁其振下讲行长期的示踪.
- 杨志军白妙春陈中灿戴宜武徐如祥
- 关键词：神经干细胞骨髓基质细胞核磁共振成像
