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嗜铬粒蛋白N端片段基因在枯草杆菌中的表达及表达产物的活性分析被引量：7: 2004年; 嗜铬粒蛋白 (CGA)是存在于分泌细胞的由 43 9个氨基酸组成的可溶性蛋白。近年的研究发现CGA的N端具有抗血管收缩、抗细菌和抗真菌的功能。为了寻找高效低毒的抗真菌片段 ,利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端 1 76位氨基酸 (CGA1 76)的DNA片段 ,并将之克隆进本实验构建的枯草杆菌诱导型表达载体pSBPTQ ,获得含CGA1 76基因的重组质粒pSVTQ ,转化蛋白酶三缺陷的枯草杆菌DB40 3。经蔗糖诱导后 ,CGA1 76片段在枯草杆菌DB40 3 (pSVTQ)中获得表达 ,产物分泌到细胞外 ,分泌量约为 5mg L ,占总分泌蛋白的 13 3 %。测试了表达产物对几种丝状真菌和酵母的抑制作用 ,发现在 4μmol L的浓度下 ,枯草杆菌表达的重组CGA1 76对镰刀菌。; 李瑞芳罗进贤张添元; 关键词：枯草杆菌基因表达酵母丝状真菌

嗜铬粒蛋白N区抗真菌活性片段研究被引量：11: 2006年; 为寻找高效低毒的抗真菌药物,利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端18-76、18-66和31-76位氨基酸(CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76)的DNA片段,将之克隆进枯草杆菌诱导型表达载体pSBPTQ,获得3种重组质粒pSC18-76、pSC18-66和pSC31-76,转化枯草杆菌DB1342。SDS-PAGE分析结果显示:经蔗糖诱导后,CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76片段分别在枯草杆菌工程菌中获得表达,产物分泌到细胞外。表达量分别为5.6 mg/L、5.3 mg/L和5.6 mg/L。利用孔穴琼脂扩散法检测表达产物的抗真菌活性,并与CGA1-76进行比较,发现CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76对烟曲霉菌、黄曲霉菌、石膏样小孢子菌和白念珠菌均有抑制作用,并以CGA31-76对白念珠菌的抑制作用为最强,CGA18-66对除白念珠菌之外的另3种测试真菌的抑制作用较强,而CGA18-76对测试真菌的抑制作用最弱。; 李瑞芳张添元罗进贤王芳宇顾取良甘菁菁肖凡; 关键词：枯草杆菌抗真菌活性

钙网蛋白122～180片段基因克隆、表达和活性分析被引量：5: 2004年; 钙网蛋白是高等动物细胞中普遍存在的一种钙结合蛋白 ,近年发现它及其N端 1～ 180位氨基酸能抑制内皮细胞生长和血管生成 .为了寻找高效和小分子质量的血管生成抑制因子 ,用PCR技术扩增出钙网蛋白N端12 2～ 180位氨基酸的DNA序列 ,克隆进原核表达载体pET 3c ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导后 ,该片段以包涵体形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 35 4 % .包涵体经变性溶解、复性和初步纯化后 ,纯化产物可以抑制人脐静脉内皮细胞的生长 ,鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成和小鼠原位黑色素瘤的生长 .; 陈宏张添元罗进贤胡志上; 关键词：钙网蛋白内皮细胞血管血管生成抑制因子抗药性

人血管能抑素免疫兔抗血清制备及其特性测定被引量：1: 2003年; 纯化的人血管能抑素包涵体进行SDS＿PAGE分离,切胶回收目的蛋白,与弗氏不完全佐剂充分乳化后,进行多点皮下注射免疫新西兰白兔,制备兔抗人血管能抑素抗血清,抗血清去除交叉反应抗体后,进行WesternBlotting分析抗血清与人血管能抑素及其N端和C端片段的抗原抗体反应特性。结果表明,经过4次加强免疫后,获得了高效价的兔抗人血管能抑素抗血清。抗血清去除交叉反应抗体后,WesternBlotting分析表明,它能与人血管能抑素发生特异的抗原抗体反应,同时还能与人血管能抑素的N端片段和C端片段发生特异性较弱的抗原抗体反应。证明制备的兔抗人血管能抑素抗血清能应用于人血管能抑素及其N端和C端片段免疫学研究中。; 贺国安罗进贤李瑞芳张添元吴群悦; 关键词：N端片段 C端片段抗血清免疫

利用枯草杆菌整合表达嗜铬粒蛋白抗真菌片段被引量：6: 2004年; 为实现CGA1-76片段基因在枯草杆菌中的稳定表达,将CGA1-76片段基因的表达元件重组到枯草杆菌转座子质粒pHV1249微转座子mini＿Tn10内,利用mini＿Tn10将CGA1-76片段基因的表达元件整合到枯草杆菌DB1342染色体上,用氯霉素和红霉素筛选枯草杆菌转座工程菌DB1342(TnSVTQ)。DB1342(TnSVTQ)在无选择压力条件下经10d连续传代培养,转座子内氯霉素抗性丢失率为0%,说明转座子稳定整合在DB1342染色体上。SDS＿PAGE和免疫印迹分析结果表明,在蔗糖诱导下,CGA1-76片段基因在DB1342(TnSVTQ)中获得表达,产物被分泌到细胞外。孔穴琼脂扩散法测定表达上清的抑制真菌活性,结果表明重组CGA1-76能抑制烟曲霉菌和黄曲霉菌的生长,抑菌圈直径分别为9mm和8mm。; 李瑞芳罗进贤张添元贺国安吴江雪官文俊; 关键词：基因表达枯草杆菌抗真菌活性

可降解淀粉酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用被引量：3: 2007年; 将酿酒酵母的rDNA片段,黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因表达盒及G418抗性基因表达盒重组进经过改造的质粒pSP72,构建酿酒酵母整合型质粒YIp4RGAn及YIp19RGAn,转化酿酒酵母实验室菌株GRF18、生产菌株JL108、SD和JM,获得能高效表达葡萄糖淀粉酶和分解淀粉的酿酒酵母基因工菌。Southern印迹分析证明,葡萄糖淀粉酶基因已整合进工程菌染色体。这些工程菌在含有20%淀粉的培养基中培养,产酒率都在11%以上。; 程少菊张添元罗进贤吴群悦; 关键词：降解淀粉酒精生产重组DNA技术

枯草杆菌工程菌高密度发酵抗真菌肽的纯化与活性分析被引量：2: 2006年; 用30 L发酵罐研究了抗真菌肽枯草杆菌工程菌B.subtilisDB1342(pSC18 66)的高密度发酵工艺.通过补料和蔗糖诱导24 h后,工程菌DB1342(pSC18 66)生物量的A600值达到53,目的蛋白分泌量为25 mg/L.发酵液经硫酸铵沉淀浓缩后,过DEAE-Sephadex A 25离子交换柱和Sephadex G 75分子筛层析进行纯化,产物纯度达到90%以上.抑制真菌实验结果显示:纯化产物能抑制白假丝酵母、镰刀菌和链格孢霉菌的生长.; 李瑞芳罗进贤张添元顾取良官文俊甘菁菁; 关键词：抗真菌肽枯草杆菌高密度发酵纯化

双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定被引量：9: 2006年; 利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。; 李瑞芳张添元罗进贤; 关键词：枯草杆菌诱导型

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广东省自然科学基金(011207)