中国博士后科学基金(2012T50235)
- 作品数：6 被引量：27H指数：3
- 相关作者：杨强徐宝山伍耀宏马信龙许海委更多>>
- 相关机构：天津医院天津理工大学天津医科大学更多>>
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- 新型脱细胞骨基质材料的组织学结构及其细胞相容性观察被引量：3
- 2013年
- 目的对新型脱细胞骨基质材料(acellular bone matrix,ACBM)的组织学结构及细胞相容性进行观察,探讨其作为组织工程骨支架的可行性。方法取健康18～24月龄雄性杂种犬股骨头负重区骨柱,高压水枪冲洗、脱脂,Trixon X-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞等理化处理,制备新型ACBM支架;对其行扫描电镜观察,HE染色、天狼星红染色及Hoechst 33258染色,评估其脱细胞程度及结构。采用密度梯度离心法分离培养犬BMSCs,取第3代BMSCs种植至ACBM支架上,MTT法分析支架浸提液毒性;复合培养3 d行倒置显微镜、扫描电镜、活/死细胞荧光染色、组织学等观察细胞在支架的生长、分化情况。结果 HE染色示ACBM支架去细胞彻底,无细胞碎片残留;天狼星红染色示支架呈深红及黄红相间染色;Hoechst 33258染色未见细胞残留。扫描电镜观察示ACBM支架内孔洞相互贯通,具有天然骨的孔径和孔隙率。MTT法检测示,培养1～6 d不同浓度(25%、50%、100%)支架浸提液与对照H-DMEM培养液吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。倒置显微镜、扫描电镜、组织学观察结果均显示细胞在支架上黏附良好,增殖显著,细胞基质分泌增加;活/死细胞染色示ACBM支架内细胞均呈绿色。结论 ACBM支架去细胞彻底,具备良好的孔径和孔隙率,无毒,细胞相容性良好,可作为良好的支架载体用于组织工程骨的构建。
- 赵艳红杨强彭江郭全义夏群马信龙徐宝山赵斌张莉伍耀宏刘越许文静卢世璧
- 关键词：组织工程骨细胞相容性
- 羊纤维环部分缺损动物模型的构建被引量：4
- 2016年
- 目的：建立可用于椎间盘缺损修复研究的纤维环部分缺损动物模型。方法使用image J 1.46r软件测量5根羊脊柱X线片T12/L1～L6/S1椎间隙高度，轴向剖开T12/L1～L6/S1椎间盘，测量拟作缺损处纤维环厚度，使用11号尖刀在3根离体羊脊柱T12/L1～L5/6椎间盘左前方制作上底3 mm、下底5 mm、高5 mm、厚3 mm，下底朝向髓核的梯形缺损，上述羊脊柱均取自1岁龄绵羊。采用微创外侧手术入路在2只1岁龄绵羊T12/L1～L5/6椎间盘左前方制作相同规格的梯形缺损。通过轴向剖开椎间盘测量梯形缺损的边长、对切取的纤维环和少量髓核称质量，以此评估所制作的椎间盘梯形缺损。结果绵羊腰椎间隙高度为（4.45±0.28）mm，拟作缺损处纤维环厚度为（4.08±0.50） mm，分别与拟作梯形缺损的厚度（3 mm）和高度（5 mm）差异有统计学意义（P〈0.05）；离体羊腰椎间盘梯形缺损的上底（3.03±0.09）mm、下底（5.03±0.09）mm、高度（4.97±0.10）mm和厚度（3.02±0.06）mm分别与梯形缺损预定值（上底3 mm、下底5 mm、高度5 mm和厚度3 mm）之间的差异无统计学意义（P〉0.05）；从离体和在体的羊腰椎间盘梯形缺损处取出的纤维环及髓核质量分别为（0.162±0.011）g和（0.166±0.014）g，两者差异无统计学意义（P＞0.05）。结论通过微创外侧手术入路，使用实验中制作梯形缺损的方法可以简单、安全、可靠地制作出符合要求、能用于椎间盘缺损修复研究的羊纤维环部分缺损的动物模型。
- 袁秋明徐宝山杨强刘越姜洪丰张杨杜立龙祁霁舟赵家宁马信龙
- 关键词：椎间盘切除术绵羊
- 新型一体化纤维环-髓核双相支架的制备与评估被引量：9
- 2013年
- 目的用脱细胞脱钙骨基质和脱细胞髓核基质构建新型一体化纤维环-髓核双相支架,并进行理化检测,探讨其作为组织工程椎间盘支架的可行性。方法取猪股骨近端松质骨,塑形成外径10 mm、内径5 mm、厚3 mm的骨环,经脱脂、脱钙、脱细胞处理制备成纤维环相支架;取猪尾髓核组织,Triton X-100和脱氧胆酸联合脱细胞后粉碎、离心,制备脱细胞髓核基质;将制备的脱细胞髓核基质注入纤维环相支架中央,冷冻干燥,联合应用紫外照射和碳化二亚胺进行交联,制备一体化纤维环-髓核双相支架。通过大体观察、HE染色、扫描电镜观察支架结构;测定支架的孔隙率、吸水率、压缩弹性模量;MTT法检测25%、50%、100%支架浸提液对新西兰大白兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stemcells,ADSCs)增殖的影响;将ADSCs接种到支架上,活/死细胞染色观察细胞在支架上的活性。结果大体观察支架呈乳白色;HE染色可见支架均质红染,无细胞成分残留;扫描电镜可见外层纤维环相支架孔径大小均匀一致,孔隙相互贯通,中央脱细胞髓核基质微丝相互连接,形成均匀网状结构,交界处连接紧密。纤维环相支架孔径为(343.00±88.25)μm,一体化纤维环-髓核双相支架孔隙率为82.98%±7.02%、吸水率为621.53%±53.31%,压缩弹性模量为(89.07±8.73)kPa。经MTT测定支架浸提液对ADSCs增殖无影响;活/死细胞染色可见细胞在支架上生长良好,无死细胞。结论用脱细胞脱钙骨基质和脱细胞髓核基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架具有合适的孔径和孔隙率且无毒,力学性能与人正常椎间盘接近,是构建组织工程椎间盘的理想支架载体。
- 许海委徐宝山杨强李秀兰马信龙夏群张春秋伍耀宏
- 不同方法诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞分化的对比研究被引量：1
- 2014年
- 目的 分别用细胞共培法和诱导液培养法诱导脂肪干细胞（adipose-derived stemcells,ADSCs）向软骨细胞分化,比较两种方法的诱导效果.方法 分离培养新西兰大白兔ADSCs和软骨细胞,分别培养至第2代用于实验.根据实验目的将实验分为三组：（1）对照组：将ADSCs接种于6孔板,普通高糖培养液培养;（2）细胞共培组：将软骨细胞和ADSCs分别接种于Transwell6孔板的上层和下层,普通高糖培养液共同培养;（3）诱导液培养组：将ADSCs接种于6孔板,用软骨诱导液进行培养.倒置显微镜观察各组ADSCs的形态变化,14d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因（蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9）的表达情况.结果 细胞共培组和诱导液培养组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,其中诱导液培养组染色更深,对照组为阴性.荧光定量PCR结果显示Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的基因转录水平细胞共培组（1.427±0.066,2.128±0.076,1.082±0.081）和诱导液培养组（3.438±0.108,4.297±0.147,2.929±0.090）明显高于对照组（0.040±0.021,0.128±0.038,0.098±0.022） （P ＜0.05）,且诱导液培养组高于细胞共培组（P＜0.05）.结论 细胞共培法和诱导液培养法均可诱导ADSCs向软骨细胞定向分化,诱导液培养法诱导效果更好.
- 许海委徐宝山杨强夏群李秀兰张杨马信龙伍耀宏刘子颐
- 关键词：干细胞软骨细胞细胞诱导
- 以骨基质明胶及软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究被引量：3
- 2013年
- 目的以骨基质明胶和软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架，并检测其理化性能及细胞相容性。方法制备中空骨基质明胶环，并注入脱细胞软骨匀浆，经冷冻干燥、交联后制备成一体化纤维环-髓核双相支架。行Hoeehst33258、天狼星红、HE染色，扫描电镜观察支架内部结构，检测支架孔隙率和吸水率，检测双相支架复水后的力学性能。分离山羊纤维环和髓核细胞，接种至双相支架的相应部位，体外培养48h，扫描电镜、活／死细胞染色评价支架与细胞的生物相容性。结果镜下Hoechst33258染色未见细胞残留，天狼星红染色阳性，HE染色示两部分结合紧密。扫描电镜可见支架呈多孔结构，孔隙相连通，纤维环相孔径为（401．4±13．1）μm，髓核相孔径为（112．4±21．8）μm。支架孔隙率为73．37％±2．56％，支架吸水率为655．7％±78．6％。支架压缩弹性模量为（49．06±15．57）kPa，小于正常椎间盘的（135．9±28．9）kPa，但在同一数量级。扫描电镜观察细胞黏附于支架表面，细胞周围有基质分泌，live／dead细胞染色示细胞在支架上活性良好。结论以天然骨基质明胶和软骨基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架，无免疫原性，具有良好的孔径和孔隙率，支架两部分连接处结合紧密，在结构、生化成分及生物力学性能上与椎间盘组织相似，且具有良好的生物相容性。
- 伍耀宏徐宝山杨强马信龙夏群李秀兰胡永成张杨张春秋许海委
- 关键词：椎间盘细胞外基质
- 细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究被引量：7
- 2013年
- 目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。
- 许海委徐宝山杨强李秀兰张杨张春秋伍耀宏崔丽
- 关键词：脂肪来源干细胞软骨细胞共培养诱导分化
