国家自然科学基金(30671837)
- 作品数：9 被引量：53H指数：5
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- 弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析被引量：8
- 2007年
- 目的克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。结果从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4%,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6%(P<0.05)。结论原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。
- 王琼吴焜陈晓光郝丽程璐
- 关键词：弓形虫基因表达免疫反应性
- BAG1基因在弓形虫速殖子与缓殖子转化中作用的初步研究
- 目的探讨弓形虫缓殖子期特异蛋白BAG1基因的功能及在速殖子与缓殖子相互转化中的作用.方法将构建好的以弓形虫速殖子期特异抗原SAG1基因启动子驱动的GFP蛋白基因为筛选标志的且耙向BAG1基因的可遗传可诱导的RNAi载体p...
- 丁洁琼吴焜谭峰陈晓光
- 关键词：弓形虫速殖子GFP电穿孔
- 文献传递
- 弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫免疫检测中的应用被引量：10
- 2007年
- 目的评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景。方法以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓形虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板,分别检测弓形虫急性和慢性感染血清,评价试剂盒检测的敏感性和特异性。结果经Ni-NTAAgarose和割胶纯化,得到了纯度为95.86%的弓形虫多表位重组可溶性抗原。以3!g/ml的抗原浓度包被ELISA微孔板,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测。结果检测小鼠血清141份,其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%。检测兔血清24份,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%,总一致性为91.5%。结论以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景。
- 杨培梁李华周晓红彭鸿娟吴焜陈晓光
- 关键词：弓形虫多表位基因重组抗原免疫诊断ELISA试剂盒
- 弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统的构建被引量：3
- 2008年
- 目的构建弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统,为弓形虫基因功能研究提供工具。方法通过PCR和酶切连接,首先构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)基因启动子驱动的绿色荧光蛋白基因载体pBSK-SAG1/5UTR-eGFP-SAG1/3UTR(pBSK-SAG1/GFP),然后构建以弓形虫热休克蛋白HSP70基因启动子驱动的反向重复序列RNAi载体pBSK-HSP70/5UTR-IntronC-HSP70/3UTR,将载体pBSK-SAG1/GFP中的SAG1/5UTR-eGFP-SAG1/3UTR片段克隆到载体pBSK-HSP70/5UTR-IntronC-HSP70/3UTR中形成载体pBSK-GFP-Hairpin,再将该载体中的GFP-Hairpin片段克隆到载体pHANA-0.5中形成弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统pHANA-hairpin。通过PCR分别扩增SAG1和缓殖子蛋白1(BAG1)基因的正向和反向序列,通过酶切连接,将正向和反向序列克隆到载体pHANA-hairpin中,分别构建靶向SAG1和BAG1基因的RNAi载体pHANA-hairpin/SAG1和pHANA-hairpin/BAG1。结果酶切鉴定和测序结果表明成功构建载体pHANA-hairpin、pHANA-hairpin/SAG1和pHANA-hairpin/BAG1。结论弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统成功构建,为下一步基因功能研究奠定基础。
- 吴焜程璐王琼郝丽陈晓光
- 关键词：弓形虫RNA干扰反向遗传学速殖子
- 弓形虫研究的过去、现在与未来被引量：18
- 2009年
- 弓形虫为顶复动物门寄生原虫,呈世界性广泛分布,可感染所有温血动物,并在宿主免疫功能低下或受抑制时导致严重的疾患,其极高的流行性和致病的机会性已越来越引起人们的关注。本文回顾了弓形虫研究的历史,综述了目前弓形虫研究的热点并提出了在今后研究中需要解决的问题。
- 陈晓光谭峰
- 关键词：刚地弓形虫弓形虫病
- 弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系的建立被引量：3
- 2008年
- 目的建立弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,接种于NIH3T3细胞单层,进行体外培养。接种4h后,换用pH8.1的碱性培养基进行速殖子向缓殖子的诱导转化培养,RT-PCR检测缓殖子蛋白1(BAG1)基因的表达。将诱导的缓殖子重新用pH7.2的培养基在常规环境下培养,诱导缓殖子向速殖子转化。为探索温度对速殖子向缓殖子转化的影响,将接种RH株速殖子的NIH3T3细胞分别放在37℃、39℃、41℃、43℃中诱导转化培养,RT-RCR检测BAG1基因的表达。结果弓形虫RH株能在NIH3T3细胞单层中生长增殖,更换高pH值碱性培养环境后,能诱导弓形虫速殖子转化为缓殖子,RT-PCR检测出缓殖子期特异蛋白BAG1基因的表达,并且随着诱导时间的延长,BAG1基因mRNA的转录水平逐渐提高,表明有更多的速殖子转化为缓殖子。恢复pH7.2的常规培养条件,碱性诱导的缓殖子能转化为速殖子。在41℃诱导条件下,能诱导RH株速殖子转化为缓殖子。结论成功构建弓形虫体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系,为转化机制的研究奠定基础。
- 吴焜王琼郝丽程璐陈晓光
- 关键词：弓形虫体外培养速殖子
- 弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析被引量：5
- 2008年
- 目的克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列,对比不同毒力弓形虫株(PRU、RH、ME49)中SAG2C基因序列,进行生物信息学分析。方法根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从Prugniaud(PRU)株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因,克隆入pMD19-T载体并进行序列测定。应用DNAMAN软件、NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性;利用生物信息学网站ExPASy(http://us.expasy.org/)对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒,测序结果表明,获得SAG2C基因序列1225bp,全长cDNA序列1095bp,编码364个氨基酸。同源性分析显示,弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97.14%;Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96.89%;编码氨基酸序列同源性为92%,N端为信号肽,C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白,存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域。结论成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列,序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白。
- 程璐陈晓光吴焜杨培梁
- 关键词：弓形虫基因克隆生物信息学
- 弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系的初步建立
- ＜正＞目的建立弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系。方法复苏液氮冻存的弓形虫RH株速殖子,接种小鼠腹腔,连续转种3代后,用生理盐水冲洗小鼠腹腔,纯化弓形虫RH株速殖子,按一定比例接种于COS-7细胞内进行体外培养。分别在第1...
- 丁洁琼谭峰吴昆陈晓光
- 文献传递
- 弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系的建立被引量：3
- 2010年
- 目的建立弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,按一定比例和条件接种于COS-7细胞内进行体外培养。分别在接种后第1、2、3、4、5、6天观察细胞和虫体的形态并提取TotalRNA,用RT-PCR的方法检测速殖子期特异性蛋白SAG1基因、缓殖子期特异性蛋白BAG1基因和SAG2C基因的表达。结果随着速殖子在COS-7细胞中培养时间的延续,虫体的数量逐渐增多,但增殖速度逐步减缓;虫体在细胞内的排列方式也在不断变化,由成对的弧形、玫瑰花形或簇形、变成半圆形最后形成圆形的类包囊样结构。RT-PCR检测显示:速殖子期特异性蛋白SAG1基因在培养的第1～6天均有表达,且表达量呈递增趋势;缓殖子期特异性蛋白BAG1基因从第2天开始出现表达,随时间延续表达量逐渐增加;缓殖子期特异性蛋白SAG2C基因从第5天开始表达,第6天表达量增加。以上结果表明有越来越多的速殖子转化为缓殖子。改变培养条件,缓殖子也能向速殖子转化。结论成功构建弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转化体系,为其转化机制的研究奠定了基础。
- 丁洁琼吴焜谭峰陈晓光
- 关键词：刚地弓形虫体外培养速殖子
- TORCH病原及其检测技术研究进展被引量：9
- 2008年
- TORCH是一组具有胎儿致畸作用病原微生物的缩写,妊娠早期感染危害更大,因此准确的产前诊断是避免不良妊娠结局的关键。本文就TORCH病原及其检测技术的研究进展予以综述。
- 程璐陈晓光
- 关键词：TORCH妊娠病原学
