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国家自然科学基金(30371479): 作品数：25 被引量：90H指数：6; 相关作者：宋方洲易发平潘巍巍马永平成海恩更多>>; 相关机构：重庆医科大学嘉兴学院日本九州大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金教育部“春晖计划”重庆市教委科研基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学化学工程更多>>

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定(英文)被引量：2: 2006年; X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.; 郭风劲宋方洲易发平成海恩; 关键词：酵母双杂交转录因子诱饵

一个新的人NFBD1启动子的鉴定与分析被引量：4: 2007年; 目的:鉴定分析NFBD1启动子,为进一步研究其转录调控奠定基础.方法:综合应用生物信息学分析和异构体特异性的巢式RT-PCR技术鉴定NFBD1转录起始位点和转录变异体;高保真PCR方法扩增NFBD1基因启动子区域并分别定向克隆入pGL3-basic和pGL3-enhancer载体,构建NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体;荧光素酶分析检测启动子活性;生物信息学方法预测转录因子结合位点.结果:鉴定了一个新的NFBD1转录起始位点和转录变异体,构建了2个含有长度分别为2.5和1.2kb的NFBD1启动子序列的荧光素酶报告基因重组体以及2个相应的含有外源增强子的NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,该启动子区域具有启动子活性,且能被外源增强子有效驱动,是一个新的人NFBD1启动子.转录因子结合位点预测分析表明,该启动子区域缺乏典型的CCAAT盒和GC盒,但含有TA-TA盒以及STAT1,MZF1和MAZ等潜在的转录因子结合位点.结论:鉴定了一个新的NFBD1启动子.; 卜友泉宋方洲易发平马永平; 关键词：转录调控

Cyclin E基因siRNA真核载体的构建及干扰效果的初步鉴定被引量：3: 2008年; 根据CyclinE(细胞周期蛋白E)基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向(+797^+819)位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.; 陈济潘巍巍魏丽丽袁成福易发平卜友泉宋方洲; 关键词：RNA干扰细胞周期蛋白E HELA细胞细胞周期

人乳头瘤病毒引起裸鼠生殖系统病变的研究: 2009年; 重组的腺病毒Ad-CMV-E6/E7和Ad-K14-E6/E7在293细胞中包装后得到上清液,将Ad-CMV-E6/E7和Ad-K14-E6/E7病毒上清液以及做为对照的重组腺病毒空载体pAd-CMV和pAdtrack-K14的上清液,经过纯化后,通过裸鼠的尾缘静脉注射到裸鼠体内,每天注射0.05 mg雌激素给注射病毒的裸鼠,同时做对照。12周后给裸鼠注射2.5%的阿佛丁进行麻醉,取其子宫、阴道、卵巢、乳腺等组织,浸泡在3.75%的多聚甲醛中4℃固定过夜,做石蜡包埋切片、HE染色、免疫组化检测P53蛋白和Bcl-2蛋白的表达,取裸鼠的各个组织提取DNA、RNA和蛋白质,然后分别检测有无重组腺病毒的感染、病毒表达的情况及E6蛋白的表达。HE染色结果显示注射腺病毒Ad-K14-E6/E7的裸鼠(实验组2)子宫颈-子宫体移行组织增生明显。SP法免疫组化检测突变型P53和Bcl-2在该组裸鼠的子宫基质细胞表达增加,并且RT-PCR检测该组裸鼠子宫组织也有E6/E7的表达,Western Blot检测该组子宫组织也有E6蛋白的表达。动物实验结果表明K14启动子增加了E6/E7在裸鼠子宫组织的表达,同时也发现该组裸鼠的子宫颈-子宫体移行组织有增生改变。; 潘巍巍曹利仙易发平徐营卜友泉赖国旗马永平宋方洲; 关键词：人乳头瘤病毒腺病毒 E6/E7基因裸鼠

一氧化氮信息传递通路中相互作用蛋白研究进展: 2005年; 酵母双杂交和三杂交系统是目前研究细胞内信号转导、蛋白质相互作用比较常用的实验技术体系。该文综述了一氧化氮信息传递通路中相互作用蛋白的研究策略及研究现状,对于揭示一氧化氮的各种病理生理学效应具有重要意义。; 郭风劲宋方洲; 关键词：信号转导酵母双杂交系统结构域

人白介素24基因诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的实验研究被引量：3: 2007年; 目的:研究人白介素24(hIL-24)在体外诱导宫颈癌CaSki细胞凋亡及其作用机制.方法:①以脂质体包裹重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-hIL-24转染Ca Ski细胞;②利用RT-PCR技术检测处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平变化;③Western Blot分析处理后Ca Ski细胞中抑癌蛋白P53水平的变化;④流式细胞仪分析处理后的Ca Ski细胞凋亡情况.结果:处理后Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的mRNA水平下降,抑癌蛋白P53水平增加,细胞凋亡率升高.结论:真核表达载体介导的hIL-24基因体外转染宫颈癌Ca Ski细胞后,能抑制Ca Ski细胞中HPV E6癌基因的表达,使抑癌蛋白P53恢复活性,促使宫颈癌Ca Ski细胞凋亡.; 石华成海恩张溢郭风劲易发平马永平宋方洲; 关键词：CA E6基因蛋白质P53 细胞凋亡

人乳头瘤病毒关键基因在裸鼠体内表达的初步研究被引量：2: 2009年; 目的:初步研究HPV16E6/E7基因在裸鼠体内不同组织引起的病变。方法:将重组腺病毒Ad-CMV-E6/E7、Ad-K14-E6/E7病毒上清以及作为对照的重组腺病毒空载体pAd-CMV和pAdtrack的上清液,经过纯化后,通过裸鼠的尾缘静脉注射到裸鼠体内,并每天注射0.05mg雌激素到注射病毒的裸鼠,同时做阴性对照。12周后给裸鼠注射2.5%阿佛丁进行麻醉,并将其耳朵、头颈部皮肤、口腔黏膜、结肠、直肠、子宫颈-阴道移行区等组织取出,浸泡在3.75%多聚甲醛中4℃固定过夜,然后做石蜡包埋切片、HE染色、免疫组化检测P53蛋白和Bcl-2的表达,取裸鼠的各个组织提取DNA、RNA和蛋白质,然后分别检测有无重组腺病毒的感染、病毒表达的情况及E6蛋白的表达。结果:实验组1注射腺病毒Ad-K14-E6/E7的裸鼠组织HE染色结果显示裸鼠子宫颈-阴道移行处的增生较明显。SP法免疫组化发现突变型P53和Bcl-2在该组裸鼠的子宫颈-阴道移行处表达都增加(P<0.05),并且RT-PCR检测子宫颈-阴道移行处组织也有E6/E7的表达,Western blotting检测该组织也有E6蛋白的表达。结论:K14启动子增加了E6/E7在裸鼠子宫颈-阴道移行处的表达,并且使子宫颈-阴道移行处的上皮组织发生病变。; 潘巍巍徐营易发平曹利仙卜友泉赖国旗宋方洲; 关键词：乳头状瘤病毒腺病毒基因 E6/E7

人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定被引量：6: 2006年; 目的:利用AdEasy系统构建人乳头瘤-16(HPV-16)E6E7基因重组腺病毒,并通过WesternBlot方法检测E6E7蛋白的表达.方法:将质粒pET-32a(+)-E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-E6E7,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-E6E7,经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-E6E7;用包装后的病毒上清再次感染293细胞,提取细胞中的蛋白,通过WesternBlot方法检测E6E7蛋白的表达.结果:连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-E6E7;经人胚肾293细胞包装,3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010pfu/L滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-E6E7重新感染人胚肾293细胞3d后,提取细胞蛋白,WesternBlot检测,E6E7有明显表达.结论:利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒AdE6E7.; 潘巍巍成海恩赖国旗易发平马永平宋方洲; 关键词：人类乳头状瘤病毒腺病毒科

人类XBP1基因5′上游DNA序列的转录激活功能分析(英文)被引量：1: 2006年; 目的分析人类转录因子X-盒结合蛋白1(X-box binding proteinⅠ,XBP1)基因启动子在不同细胞系中转录活性的差别,研究其转录调控机制。方法在对XBP1基因进行生物信息学分析的基础上,设计6种XBP1启动子缺失突变体,分别包括XBP1基因5′上游-1039~66bp、-859~66bp、-623~66bp、-351~66bp,-227~66bp、-227^-45bp,针对每一种缺失突变体构建相应的氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltansferase,CAT)报告基因载体,再分别瞬时转染K562、HepG2、NIH-3T3和L02细胞,应用报告基因CAT瞬时表达系统,检测XBP1每一种缺失突变体在K562、HepG2、NIH-3T3和L024种不同细胞中的活性差异,并进一步确定XBP1基因启动子的具体调节部位。结果成功获得XBP1基因启动子6种缺失突变体的正确克隆和6种相应的报告基因载体p1-XBP1p,p2-XBP1p,p3-XBP1p,p4-XBP1p,p5-XBP1p,p6-XBP1p,每一种报告基因转染K562、HepG2、NIH-3T3和L024种不同细胞系后,p4-XBP1p和p5-XBP1p在K562、HepG2细胞中的转录活性均高于其它报告载体,p5-XBP1p在HepG2细胞中转录活性最高;而6种报告基因载体在NIH-3T3小鼠成纤维细胞中不具有转录活性。结论XBP1基因的转录激活能力在不同细胞中有所差异,其表达活性具有一定的细胞类型特异性,与细胞类型和细胞状态密切相关;XBP1基因启动子的-227~66bp区域是该启动子的核心部位,而且核心启动子区包括ATG翻译起始密码子的下游部位,这一部位是转录活性的重要部位,一旦缺失,XBP1基因启动子会丧失活性。; 郭风劲成海恩易发平彭惠民宋方洲; 关键词：启动子转录调控

细胞周期素E的干扰RNA对HeLa细胞增殖的抑制作用被引量：7: 2007年; 目的利用RNAi技术下调宫颈癌HeLa细胞中cyclin E mRNA水平，研究对HeLa细胞增殖及周期的影响。方法构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体，脂质体转染HeLa细胞下调细胞中cyclin E mRNA含量。RT-PCR检测抑制效果；MTr检测细胞生长情况；流式细胞仪分析HeLa细胞周期变化。结果成功构建针对cyclin E基因的RNAi真核表达载体，可以特异下调cyclin E mRNA含量，并抑制细胞恶性增殖。细胞周期分析显示干扰使细胞停留在G0-G。期，S期细胞明显减少。结论RNAi能特异地下调HeLa细胞中cyclin E mRNA含量，抑制宫颈癌细胞恶性增殖，提示cyclin E可能成为宫颈癌基因治疗中的一个新的靶点。; 陈济潘巍巍成海恩魏丽丽袁成福石华易发平马永平宋方洲; 关键词：RNA干扰细胞周期素E HELA细胞细胞周期

国家自然科学基金(30371479)

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