国家自然科学基金(30512741)
- 作品数：3 被引量：7H指数：1
- 相关作者：赵宝昌刘淑清孙明忠更多>>
- 相关机构：大连医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：理学生物学更多>>
- HPV18 E7致癌蛋白的高效表达、纯化和鉴定
- 2008年
- 目的为进一步研究人乳头状瘤病毒18(Human papillomavirus 18,HPV18)E7蛋白的结构与功能。方法构建HPV18 E7的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白质粒pGEX-6P-1-GST-HPV18E7,重组质粒转入大肠埃希菌BL21进行可溶性融合蛋白的高效表达。结果柱上切除法去除GST标签,表达产物经glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化,获得了SDS-PAGE和HPLC-ESI-MS纯度的HPV18 E7均质蛋白,非变性PAGE和凝胶过滤表明HPV18 E7以稳定的单体形式存在于水溶液中。高压液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)分析得到HPV18 E7精确分子量为12865.0 Da,与其理论值吻合。纯化蛋白经HPLC-ESI-MS/MS鉴定为目的产物,鉴定出的9个匹配肽段覆盖率为HPV18 E7整个氨基酸序列的96.5%。结论本文所建立的技术可以有效地大量制备HPV18 E7,为进一步研究其结构与功能和致癌机制奠定了重要的物质基础。
- 孙明忠刘淑清赵宝昌
- Ca^(2+)离子对PLA_2结构和功能的影响
- 2009年
- 摘要从旅顺产白眉蝮蛇(Glyodius blomhoffi Brevicaudaus,GBB)蛇毒(GBBSV)中首次纯化得到了电泳纯和质谱纯磷脂酶A2(GBB-PLA2)。采用电泳、质谱、等离子体发射光谱、紫外、荧光光谱测试技术对GBB-PLA2进行了系统表征。HPLC-ESI-MS法测得的精确分子量为13 965·07 amu,HPLC-ESI-MS/MS法鉴定GBB-PLA2为江浙蝮蛇和尖吻蝮蛇蛇毒PLA2的同源性蛋白,分别得到4个和1个同源性肽段。凝胶过滤、质谱和SDS-PAGE测试技术结果表明,GBB-PLA2以稳定的单体形式存在。电感耦合等离子体发射光谱分析法(ICP-AES)测得每1个磷脂酶A2含有1个Ca2+离子,Ca2+是PLA2活性所必需的。Ca2+的除去使PLA2活性降低90%,外加Ca2+明显加速PLA2水解底物DPPC的速度。Ca2+起稳定PLA2结构的作用,可使GBB-PLA2的热变性温度提高3℃。
- 刘淑清孙明忠赵宝昌
- 关键词：磷脂酶A2
- 质谱法分析蛇毒蛋白翻译后修饰被引量：7
- 2008年
- 采用SDS-PAGE分离大连黑眉蝮蛇(Gloydius Shedaoensis)蛇毒蛋白组分,Pro-Q Emerald 488糖蛋白和Pro-Q Diamond磷酸化蛋白荧光染料用于糖蛋白和磷酸化蛋白泳带染色,采用高效液相色谱电喷雾电离串联质谱(HPLC-nESI-MS/MS)法鉴定蛋白.SDS-PAGE胶上的8条糖蛋白带被分别鉴定为L-氨基酸氧化酶、金属蛋白酶、谷氨酰环化酶、C-端缺失L-氨基酸氧化酶、纤溶酶原激活物、磷脂酶A2(PLA2)和神经生长因子;5条磷酸化蛋白带被分别鉴定为Stejaggregin-A、PLA2、Crisp、金属蛋白酶P-Ⅲ和Acutolysin e precursor,与其它蛇毒来源蛋白具有一定的同源性.为进一步验证方法的可靠性,采用离子交换和凝胶过滤层析技术纯化得到了PLA2,Pro-Q Diamond染色结果显示PLA2被磷酸化.研究所得结果为进一步研究蛋白质翻译后修饰对蛇毒蛋白的生物活性、结构与功能提供了依据.
- 刘淑清孙明忠赵宝昌
- 关键词：蛇毒糖基化磷酸化高效液相色谱串联质谱法
