国家自然科学基金(20776061)
- 作品数：10 被引量：38H指数：4
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- 编码草菇中性内切葡聚糖酶Ⅰ的基因克隆与表达研究被引量：2
- 2008年
- 采用RT-PCR法,以草菇Volvariella.volvacea V23总RNA为模板,克隆了包括自身信号肽在内的中性内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egⅠ)的cDNA序列。测序结果表明,它全长1167 bp,编码389个氨基酸,推测第1～23位氨基酸为信号肽,第24～389位氨基酸为成熟肽,属于糖苷水解酶第5家族。PCR扩增成熟肽编码基因并将其插入到分泌型表达载体pPIC9K中,重组载体经SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到了1株高产中性内切葡聚糖酶Ⅰ的工程菌株P.pastoris-EGⅠ1。SDS-PAGE检测表明,重组中性内切葡聚糖酶Ⅰ分子质量约为42 ku。在甲醇诱导96h时,酶活达到3 698 U/mL。
- 王超凯李剑芳司晨妍王瑾孙军亭邬敏辰
- 关键词：草菇毕赤酵母分泌表达
- 宇佐美曲霉中β-甘露聚糖酶基因调控序列的克隆
- 2012年
- 建立了一种利用限制性内切酶酶切、pUCm-T载体连接和巢式PCR技术,基于部分已知DNA序列测定其两侧翼未知DNA序列的新方法,命名为T载体介导的PCR技术,并将此技术应用于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的β-甘露聚糖酶基因(Aus man5A)5′和3′端调控序列的克隆。结果表明:该PCR技术具有操作简便、引物特异性强、结果验证简捷、操作限制少等特点;借助于T载体介导的PCR技术、分子克隆和序列测定等手段,成功地测定了Ausman5A两侧翼的调控序列。
- 唐存多赵顺阁邬敏辰史红玲
- 关键词：宇佐美曲霉Β-甘露聚糖酶
- 圆弧青霉PG37脂肪酶的生物信息学分析
- 2010年
- 利用生物信息学软件对GenBank上登录的圆弧青霉PG37碱性脂肪酶(LipⅠ)进行预测和分析。结果表明,PG37LipⅠ全肽含多个疏水区域,无明显跨膜结构域,定位于胞外,N-末端20个氨基酸为信号肽;PG37LipⅠ成熟肽是等电点为6.16的疏水性稳定蛋白质,包含一个Lipase_3的结构域,属于α/β水解酶超家族,含磷酸化位点等多种功能性位点,具有脂肪酸代谢的功能;α-螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件,在三级结构中,Ser132-Asp188-His2413个氨基酸残基组成酶活性中心。
- 李剑芳张慧敏邬敏辰
- 关键词：生物信息学碱性脂肪酶氨基酸序列
- 脂肪酶热稳定性改造研究进展被引量：4
- 2014年
- 热稳定性改造是脂肪酶酶学性质研究的热点之一,随着技术的发展,越来越多的有效手段被用于脂肪酶热稳定性改造。作者综述了影响脂肪酶热稳定性的主要因素、提高其热稳定性的研究方法以及最新研究成果,为脂肪酶的进一步改造提供依据,并对其他酶的酶学性质改造具有借鉴意义。
- 谭中标李剑芳邬敏辰殷欣胡蝶董运海
- 关键词：脂肪酶热稳定性随机突变定向进化定点突变
- 内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达被引量：18
- 2008年
- 根据绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422菌株内切葡聚糖酶基因egⅡ的cDNA序列,设计特异引物,以重组质粒pTG19-T-egⅡ为模板,扩增得到全长1 194bp的egⅡ成熟肽cDNA片段。将该片段分别克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a(+)和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌Rosse(t DE3)和毕赤酵母GS115中进行了表达。重组大肠杆菌表达蛋白占菌体总蛋白的15%,表达产物无内切葡聚糖酶活性。重组毕赤酵母经甲醇诱导实现了分泌表达,在摇床水平上酶活性达到2 788U/ml。酶学性质分析表明,该酶作用的最适pH为4.5,pH 3.5～6.0范围内酶活性保留在80%以上;最适温度为50℃,55℃以下酶的稳定性在90%以上。
- 王瑾邬敏辰周晨妍
- 关键词：绿色木霉内切葡聚糖酶大肠杆菌毕赤酵母酶学性质
- 脂肪酶氨基酸及其二联体与最适温度的相关性分析被引量：1
- 2011年
- 基于34条微生物脂肪酶序列,用多元逐步回归法分析了影响脂肪酶最适温度的氨基酸及其二联体。结果表明:与最适温度呈正相关性的氨基酸是Y,负相关性的有I、S、K;呈正相关性的氨基酸二联体有IR、KS、NY、SA、ST和YR,负相关性的有DK、DY、IS、KA、WS、YS和QI。通过对相关性氨基酸二联体在耐热和不耐热脂肪酶中空间位置的分析发现:与最适温度呈正相关性的氨基酸二联体多数位于α-螺旋区,且分布在酶蛋白表面;而呈负相关性的多数位于β-折叠区和无规则卷曲区,一般分布于酶蛋白内部,并常出现在多肽链的N或C端。
- 李剑芳张慧敏邬敏辰
- 关键词：脂肪酶热稳定性最适温度
- 圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析被引量：7
- 2010年
- 从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 LipI基因携带的遗传信息。序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5'端存在TATAbox和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5'和3'非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对LipI基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大。
- 张慧敏李剑芳邬敏辰
- 关键词：生物信息学碱性脂肪酶基因序列
- 圆弧青霉碱性脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达
- 2010年
- 目的在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达圆弧青霉碱性脂肪酶(Alkaline lipase,LipⅠ)。方法采用RT-PCR法从圆弧青霉PG37中扩增lipⅠ基因的cDNA片段,克隆入表达质粒pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-lipⅠ,转化入毕赤酵母GS115,筛选高拷贝重组子GS115/lipⅠ,甲醇诱导表达,并对诱导表达条件进行初步优化。结果 GS115/lipⅠ在培养基初始pH6.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,于30℃诱导96h,发酵液上清中LipⅠ的活性为10.5U/ml。在培养基初始pH9.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,24℃诱导120h,GS115/lipⅠ发酵液上清中LipⅠ的活性最高,达407U/ml。结论在毕赤酵母GS115中高效表达了具有活性的圆弧青霉LipⅠ。
- 谭中标邬敏辰张慧敏李剑芳
- 关键词：脂肪酶毕赤酵母基因表达
- β-甘露聚糖酶固态发酵的产业化生产技术被引量：7
- 2008年
- 在黑曲霉LW-1-9菌株三角瓶固态发酵试验的基础上,经曲盘（Φ20.0 cm×5.0 cm）固态发酵试验,放大到30 m3固态发酵罐（Φ4.5 m×2.0 m）的产业化生产规模。固态发酵基料（其中：麸皮700-800 kg,豆饼粉或菜籽饼粉200-300 kg）总量为1 000 kg/批次,料水质量比1∶1.8-2.0,自然pH,并添加魔芋粉3%-5%,玉米浆3%-5%,（NH4）2SO41%-1.5%,CaCl20.05%-0.1%,MgSO40.05%-0.1%,KH2PO40.3%-0.5%（质量分数,相对于基料）;经灭菌、接种后,于32-36℃间断通风培养72-84 h,期间分别于第20-24小时和第36-40小时各翻曲1次,并同时补加无菌水180-200 kg。在上述发酵工艺条件下,LW-1-9菌株产业化生产β-甘露聚糖酶,活性可达每克干曲26 725-29 218 IU。
- 邬敏辰徐春梅李剑芳
- 关键词：Β-甘露聚糖酶固态发酵
- 抗肿瘤药物诱导酵母细胞凋亡及其机制被引量：1
- 2010年
- 细胞凋亡是各种抗肿瘤药物引发细胞死亡的主要方式,研究细胞凋亡发生和调节的机制,对改善和提高药物疗效,开发新型抗肿瘤药具有重要的意义。单细胞真核生物酵母能够发生细胞凋亡且凋亡机制从酵母到哺乳动物细胞高度保守,酵母已经成为研究细胞凋亡的重要模式生物。作者主要对以酵母为细胞模型,探讨常见的细胞毒类抗肿瘤药物诱导细胞凋亡过程中出现的典型凋亡特征、起关键作用的基因/蛋白,信号通路以及相关的凋亡表型等机制作一综述。
- 吴静闵柔邬敏辰陈伟
- 关键词：抗肿瘤药物酵母细胞凋亡凋亡机制
