国家自然科学基金(31271828)
- 作品数：10 被引量：63H指数：6
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- 多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化被引量：7
- 2014年
- 为建立多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株的高效电击转化体系,本实验研究菌体培养时间、电场强度、电击缓冲液、质粒用量以及电击后复苏培养时间等因素对JSa-9菌株电转化效率的影响。结果表明:Paenibacillus polymyxa JSa-9培养至OD595 nm为0.3时,电转化效率最高,为0.12×103 CFU/μg DNA;用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在电场强度17.5 kV/cm、电阻200Ω,电容25μF的电击条件下,加入1.0μg/100·mL质粒DNA,复苏培养时间18 h,电转化效率达到约为0.36×103 CFU/μg DNA;制备P.polymyxa JSa-9原生质体,在电场强度5.0 kV/cm的电击条件下,加入0.8μg/100·mL质粒DNA,电转化效率较感受态电转提高到约1.0×103 CFU/μg DNA。
- 高玲邓阳陆兆新吕凤霞别小妹
- 关键词：电转化
- 鲜切小白菜和生菜不同贮藏温度下货架期预测模型的建立被引量：9
- 2016年
- 为研究鲜切小白菜和鲜切生菜在贮藏期间的品质变化,并预测其货架期,本文以鲜切小白菜和鲜切生菜为研究对象,对其贮藏期间的感官品质、细菌总数和大肠菌群数变化进行研究,并以细菌总数为自变量对低温与室温下鲜切小白菜和生菜货架期预测模型进行拟合。结果显示,在4℃与25℃下贮藏时间分别为10 d与3 d时,两种蔬菜的感官评价均大于5分,超过了消费者接受范围,细菌总数和大肠菌群数也在该贮藏时间时超出了标准规定范围,得出鲜切小白菜和鲜切生菜在4℃与25℃下的货架期终点分别为10 d与3 d;低温与室温下鲜切小白菜和鲜切生菜货架期预测模型拟合结果分别为:SL_(4℃)=ln{ln[5.096/(N_1-1.990)]}-1/0.279+7.452和SL_(25℃)=ln{ln[3.621/(N_1-3.651)]}-1/1.124+1.512;两个预测模型的偏差因子分别为0.979和1.001,准确因子分别为1.050和1.040,表明所建立的模型是有效的。
- 高灿灿刘佳玫陆兆新吕凤霞张充赵海珍别小妹
- 关键词：鲜切生菜
- Paenibacillus polymyxa JSa-9发酵培养基优化及其在黄瓜枯萎病中的应用研究被引量：5
- 2016年
- [目的]本文旨在提高菌株Paenibacillus polymyxa JSa-9的芽孢产量并研究其芽孢液对黄瓜枯萎病的生物防治作用。[方法]采用单因素试验方法筛选最适于P.polymyxa JSa-9产芽孢的碳源、氮源和无机盐,在此基础上采用Taguchi试验方法优化各组分的最佳配比;通过田间试验研究P.polymyxa JSa-9芽孢液与其他药剂对黄瓜枯萎病的相对防效及对黄瓜幼苗生长的作用。[结果]P.polymyxa JSa-9产芽孢各组分的最优配比为麦芽浸粉15 g·L^(-1)、玉米浆15 g·L^(-1)、Ca CO_35 g·L^(-1)、Mg Cl_2·6H_2O 0.5 g·L^(-1),此条件下预测得到的芽孢产量可达到7.44×10~9CFU·m L^(-1),此时培养基的信噪比为60.13;田间试验中P.polymyxa JSa-9芽孢液相对防效达69.02%,优于发酵上清液,经芽孢液处理的幼苗植株高度为7.61 cm,单株叶片数为4.79,能显著促进黄瓜幼苗生长(P<0.05)。[结论]采用单因素试验与Taguchi试验相结合的方法优化培养基,效果显著,得到的P.polymyxa JSa-9芽孢液对黄瓜枯萎病有良好的防治效果,且具有一定促生长作用。
- 王美英王芳韩金志陆兆新别小妹
- 关键词：培养基优化黄瓜枯萎病生物防治
- 原生质体融合选育高产脂肽LI-F多粘类芽胞杆菌及融合菌株表达差异分析被引量：4
- 2015年
- 本研究以多粘类芽胞杆菌JSa-9前期诱变获得的两株带有营养缺陷型标记的菌株N1-37(Phe–)和N2-27(His–)作为亲本菌株,采用聚乙二醇作为促融剂,进行原生质体融合,筛选出高产LI-F类抗菌脂肽的融合菌株。通过HPLC对融合菌株和原始菌株产LI-F类抗菌脂肽进行定量检测,并利用实时荧光定量PCR对菌株JSa-9和融合菌株中LI-F类抗菌脂肽合成酶的关键基因fus A1、fus A2、fus C1和fus C2的差异性表达进行分析。结果表明,经过原生质融合获得一株LI-F类抗菌脂肽高产菌株F5-15。菌株F5-15的LI-F类抗菌脂肽产量为原始菌株产量的3.1倍,LI-F类抗菌脂肽合成酶的4个关键基因在融合菌株F5-15中的表达量分别是其在原始菌株JSa-9中的10.48、2.48、2.1和11.8倍。
- 闫冬韩金志别小妹陆兆新吕凤霞赵海珍张充
- 关键词：原生质体制备原生质体融合实时荧光定量PCR
- 检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立被引量：2
- 2017年
- 以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。
- 高灿灿刘佳玫栗军杰陆兆新吕凤霞张充赵海珍别小妹
- 关键词：TAQMAN探针
- 植物乳杆菌细菌素高产菌株的诱变选育及其对肉丸的防腐保鲜作用被引量：6
- 2018年
- 为了提高细菌素产量并研究细菌素对肉制品的保鲜效果,本研究以植物乳杆菌JL-A65为出发菌株,对其进行常温等离子(ARTP)诱变、甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱变与基因组改组,并将细菌素与双乙酸钠复配后添加到肉丸中。结果表明,ARTP诱变最佳处理时间为40 s,经筛选得到两株突变株A7-10和A8-110,细菌素产量提高率分别为45.1%和48.9%。MNNG诱变的最佳处理浓度为1.5 mg/mL,经筛选得到两株突变株M2-58和M7-111,细菌素产量提高率分别为46.6%和31.3%。对植物乳杆菌进行基因组改组最终得到一株融合菌株F4-23,细菌素产量为413 mg/L,较原始菌株提高了103.48%。细菌素与双乙酸钠之间存在协同作用,可以使肉制品保质期较对照延长5 d。结论:利用理化诱变结合基因组改组可以获得细菌素高产菌株,细菌素与双乙酸钠复配后可以使肉丸保质期较对照延长5 d。细菌素对肉丸具有较好的防腐保鲜效果。
- 陈瑞龙庄莹贺彬彬青舒婷胡落渟陆兆新别小妹
- 关键词：植物乳杆菌细菌素诱变基因组改组
- 枯草芽胞杆菌fmbj SrfAC-A结构域的活性测定
- 2013年
- 【目的】在体外研究surfactin合成酶的A结构域,为获得新的surfactin类似物奠定基础。【方法】本文从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)fmbj中克隆出surfactin合成酶第7个模块的A结构域基因(SrfAC-A),与表达质粒pET-23a相连后在大肠杆菌表达系统中表达,用Ni-NTA亲和柱对重组蛋白SrfAC-A进行分离纯化后测定其活性。【结果】克隆所得的A结构域对Ile有选择活性,而对其他氨基酸基本无活性。【结论】Surfactin合成酶中的A结构域能在体外独立行使其选择底物氨基酸的功能。
- 刘丽霞陆兆新吕凤霞张充别小妹
- 关键词：克隆表达活性测定
- 芽孢杆菌产抗菌脂肽调控基因快速检测被引量：11
- 2016年
- [目的]本文旨在建立一种利用PCR技术鉴别抗菌脂肽类型和筛选抗菌脂肽产生菌的快速、准确、灵敏的方法。[方法]以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的典型菌株为研究对象,针对几种代表性脂肽的合成酶基因设计特异性引物进行PCR扩增,并通过测序法验证检测结果的正确性,推测芽孢杆菌生物合成抗菌物质的潜在能力。[结果]PCR结果表明:所有检测菌株均具有Surfactin合成酶调控基因;除P.polymyxa JSa-9外,其他菌株均检测到Fengycin合成酶基因的存在;而Iturin合成酶基因仅在B.amyloliquefaciens ES-2中检测得到;B.subtilis fmbj、B.subtilis fmbR、B.subtilis fmbR-2、B.amyloliquefaciens ES-2和P.polymyxa JSa-9-81均具有Bacillomycin D合成酶调控基因;B.subtilis fmbR、PB2、fmbj、PB198、fmb4、fmb2和fmb3菌株中发现了Subtilosin A合成酶基因的存在;而只有P.polymyxa JSa-9和P.polymyxa JSa-9-81检测到Polymyxin合成酶调控基因。[结论]基于PCR快速检测和测序相结合的方法,我们建立了一种抗菌脂肽产生菌快速识别、筛选和抗菌脂肽快速鉴定的方法,该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等特点。
- 曲晓旭刘洪霞高玲陆兆新吕凤霞张充赵海珍别小妹
- 关键词：芽孢杆菌调控基因
- 多粘类芽孢杆菌JSa-9高产LI-F类抗菌脂肽突变株的选育被引量：12
- 2014年
- 为了提高多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗菌脂肽的产量,本研究采用亚硝基胍(NTG)、60Co-γ射线和低能N+离子注入3种不同诱变方法,确定了NTG最佳诱变浓度为50μg·mL-1,60Co-γ射线最佳诱变剂量为200Gy;当低能N+离子注入能量为10keV,最佳注入时间为60 s,当注入能量为20keV,最佳注入时间为30 s。最终从300株突变株中筛选得到1株苯丙氨酸缺陷型菌株N1-37和1株组氨酸缺陷型菌株N2-27,均由NTG诱变获得。以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验,N1-37和N2-27抑菌圈直径比出发菌株JSa-9分别增加45.54%和32.35%。通过高效液相色谱确定LI-F类抗菌脂肽产量,结果表明,N1-37和N2-27产LI-F类抗菌脂肽的产量是原始菌株JSa-9的1.71倍和1.4倍,经连续传代10代,试验表明2菌株遗传稳定性良好,不仅可以应用于工业生产上,还可以作为亲本菌株进行细胞融合研究。
- 闫冬别小妹陆兆新吕凤霞赵海珍张充
- 关键词：多粘类芽孢杆菌诱变育种营养缺陷型
- Bacillus subtilis 168菌株产surfactin改造被引量：8
- 2014年
- 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株基因组中含有编码surfactin合成酶系的srfA操纵子,却不产抗菌肽surfactin。运用同源重组的方法将外源的有活性的sfp基因(编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)整合入B.subtilis 168中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌和解淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上、下游找出较为保守的区域,设计引物,从枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增sfp基因,将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连接于枯草整合质粒pDG1730上,最终构建了枯草芽孢杆菌整合质粒pST-1730,利用pST-1730本身的淀粉酶E基因与B.subtilis 168菌株的基因组DNA进行同源重组整合,获得了产surfactin的重组菌株B.subtilis121。本研究为surfactin合成酶基因的改造和分析奠定了基础。
- 刘丽霞高玲别小妹陆兆新张充吕凤霞
- 关键词：同源重组BACILLUSSUBTILISSURFACTIN
