国家自然科学基金(30471679)
- 作品数：7 被引量：22H指数：3
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- 人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体的构建及测序被引量：4
- 2006年
- 目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经SpeⅠ和SalⅠ双酶切线性化的pHSER dsRNA GFP SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定。结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER dsRNA GFP SIN载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列。结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础。
- 董征学彭代智刘敬周新田易李芳严泉林恒王勇周光前
- 关键词：RNA干扰慢病毒表达载体
- 人脐血造血干细胞体外诱导朗格汉斯细胞的研究
- 2013年
- 目的采用人脐血CD34+细胞,经不同细胞因子组合诱导方案体外诱导培养朗格汉斯细胞(CD1a+细胞)并观察其产量及相关表型特点。方法联合应用人淋巴细胞分离试剂和CD34+磁珠分离和筛选人脐血CD34+细胞,以5种不同的细胞因子组合诱导方案,对分选出的CD34+细胞进行体外诱导培养,观察其生长形态变化、集落的形成,并对诱导培养第12天的CD34+细胞进行CD1a、HLA-DR等LC表型分子,以及CD40、CD80等共刺激分子表型检测。筛选出最佳的朗格汉斯细胞(Langerhans cells,LC)体外诱导方案。结果流式细胞术分析5种细胞因子方案体外诱导培养LC的结果显示,方案IV、V诱导培养12 d的CD1a+细胞百分率和CD1a+细胞数量均明显多于方案Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;方案Ⅳ诱导培养12 d的HLA-DR+细胞百分率显著高于方案Ⅴ。结论利用细胞因子组合方案IV体外诱导磁珠分选的CD34+细胞,可以获得高产量的LC细胞,为研究其功能和发生机制提供足够的细胞。
- 王丽华彭代智刘敬周新王勇
- 关键词：朗格汉斯细胞人脐血造血干细胞细胞因子体外诱导培养流式细胞技术
- 免疫磁珠分选人角朊干细胞的实验研究被引量：1
- 2007年
- 目的:探索人角朊干细胞(keratinocyte stem cells,KSCs)的免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)的方法。方法:从人包皮组织获得角朊细胞悬液,然后利用人角朊干细胞表面CD49f(整合素α6)和CD71的表达情况(CD49fbriCD71dim)通过MACS法将KSCs分选出来,在荧光显微镜下观察其荧光标记情况,同时将分选所得的CD49fbriCD71dim细胞进行体外无血清培养,观察其形态及克隆形成。结果:人角朊细胞经MACS法分选后所得的CD49fbriCD71dim细胞比率可达12．02(±6．92)%。CD49fbriCD71dim细胞经培养可见细胞为典型的上皮样特征,呈铺路石样形态,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚,折光性好,并可在5-7天左右形成全克隆,符合KSCs的特点。结论:研究表明MACS分选法可以得到较高比例的人角朊干细胞,并能进行后续培养研究,其不失为一种较理想的人角朊干细胞的分选方法。
- 罗海水彭代智周新刘敬朱崇涛严泉李星王勇
- 关键词：免疫磁珠分选克隆形成
- 人永生化角朊细胞表达干细胞表型的流式细胞术分析被引量：4
- 2007年
- 观察人永生化角朊细胞系HaCaT细胞表达的几种干细胞表型,为以该细胞系构建人组织工程皮肤和进行基因操作提供相应的实验依据。方法:采用无血清培养基对HaCaT细胞进行培养,获取处于对数生长期的细胞进行直接荧光双标法、直接荧光单标法和间接荧光单标法以分别CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133,依托流式细胞仪检测上述抗原在HaCaT细胞的表达情况。结果:特异性较高的角朊干细胞表型CD49f+D71-和K19+在HacaT细胞的百分率分别为16．6±2．8%和14．94±1．23%。CD29+HaCaT细胞为49．55±6．68%,可能包括了角朊干细胞和短暂扩增细胞。分别反映细胞黏附特性和增殖能力的CD49f+HaCaT细胞和CD71+HaCaT细胞各占98．1±0．8%和82．1±3．9%。HaCaT细胞仅表达3．43±0．77%的干细胞表型CD133。结论:人永生化角朊细胞系HaCaT细胞的表型特征表明它具有较高的角朊干细胞和短暂扩增细胞比例以及很强的黏附基底膜特性和增殖能力,提示它可以作为构建人组织工程皮肤种子细胞和基因修饰角朊干细胞的替代物。
- 朱崇涛彭代智潘峰罗婧罗海水王勇周新刘敬
- 关键词：流式细胞术组织工程皮肤基因操作
- CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果被引量：3
- 2009年
- 目的采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系（HaCaT），筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果。方法用CaCl2法将已构建好的3种pHSER—CCL20-shRNA—GFP载体（pHCG-1和pHCG-2为CCL20基因特异性，pHCG-3为CCL20基因错配）转染293FT包装出慢病毒颗粒，流式细胞术测定其病毒滴度。用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT，荧光定量RT—PCR和ELISA法分别检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平，以判断其特异性干扰效果。结果三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7．08×10^5转导单位（TU）／ml、1．88×10^5TU／ml和2．08×10^5TU／ml；感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周，获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆（HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4）及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆（HaCaT-5和HaCaT-6）。经荧光定量PCR和ELISA法检测显示，4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果，不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达（其抑制率分别为81．0％、89．0％、81．3％、77．2％），而且明显地减少CCL20蛋白分泌（其抑制率分别为70．0％、86．1％、88．1％、90．7％）。结论采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆，将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞。
- 王丽华彭代智刘敬周新王勇何升东何斌郑必祥董征学周光前
- 关键词：RNA干扰慢病毒属种子细胞
- 以HaCaT细胞为种子细胞构建新型人组织工程皮肤被引量：11
- 2007年
- 目的:评估以人永生化角朊细胞HaCaT为种子细胞构建新型人组织工程皮肤的可行性。方法:对HaCaT进行无血清培养(DK-SFM)及传代培养;取处于对数生长期的细胞进行接种;利用物理化学方法,采用SD大鼠网状层真皮制备(Acelluar dermal matrix,ADM);应用MTT比色法作生长曲线观察HaCaT细胞长满真皮支架所需时间。HE染色法观察脱细胞前后真皮支架和细胞单层及初步形成的细胞多层。结果:脱细胞真皮的细胞成分消失,组织疏松,为理想的组织皮肤支架;将HaCaT细胞按2×10~5/cm^2密度接种到ADM上,细胞长满支架的时间为5天。
- 朱崇涛彭代智周新刘敬罗海水王丽华王勇蒋丽莉
- 关键词：HACAT细胞MTT组织工程皮肤
- 人角质形成细胞基因导入效率的影响因素研究被引量：2
- 2009年
- 目的了解不同大小质粒和不同基因转染法对人KC基因导入效率的影响。方法采用脂质体转染法、阳离子多聚物转染法、电穿孔联合细胞核转染试剂转染法、慢病毒感染法，分别将不同大小的质粒[pSUPER-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、pEGFP—N2、pHSER-绿色荧光蛋白（GFP）、ploxP-EGFP]导入人永生化KC株HaCaT细胞和人胚肾细胞株293FT细胞（后者为对照）。于倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。结果（1）采用脂质体转染法可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率1．0％～3．3％）及293FT细胞（转染率80．0％～84．7％）。（2）阳离子多聚物转染法亦可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率为1．0％～3．7％）和293FT细胞（转染率81．3％～86．7％）。（3）采用电穿孔联合细胞核转染试剂转染法，可以将2种较小片段质粒pSUPER—EGFP和pEGFP-N2导入HaCaT细胞，转染率分别为22．3％和19．0％；而2种较大片段质粒pHSER-GFP和ploxP-EGFP的转染率分别为4．0％和3．3％。（4）pHSER-GFP经慢病毒包装后，导入HaCaT细胞的转染率高达97．0％，明显优于前3种转染法。结论脂质体转染法、阳离子多聚物转染法较难将外源性基因导入人KC，慢病毒感染法的转染率明显优于电穿孔联合细胞核转染试剂转染法；
- 王丽华彭代智周新刘敬王勇何升东何斌郑必祥董征学
- 关键词：转染质粒角质形成细胞基因治疗
